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本研究得到了区域创新体系的支持 &amp;#38; 教育（RISE）项目，由韩国教育部（MOE）和江原道政府（G.S.）通过江原RISE中心资助（2026-RISE-10-001）。本研究由光云大学2026年度优秀研究人员支持项目资助。

本研究使用了商业获取的去标识化人唾液混合样本。未招募人类受试者，无需机构伦理审批。
1. 唾液样本制备
<ol>
	<li>指导受试者在样本采集前至少30分钟内禁食禁饮。</li>
	<li>按照试剂供应商的说明制备唾液样本。 
	注意：本研究使用市售的混合人源唾液进行方案级别的验证。</li>
	<li>使用前轻轻混匀唾液样本，以确保其均匀性。</li>
	<li>将唾液样本储存在4 °C条件下，并在供应商推荐的保存期限内使用。</li>
</ol>
2. RBCM包被膜的制备（图1A）
<ol>
	<li>根据先前报道的方案从全血中分离红细胞膜囊泡（RBCM）16。
	<ol>
		<li>使用 commercially obtained 的人全血（以 K2EDTA 抗凝）作为 RBCM 来源。</li>
		<li>将全血在 800 × g 离心 5 分钟，去除血浆和白膜层后收集红细胞组分。</li>
		<li>用预冷的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔手动混匀，将分离得到的红细胞沉淀洗涤三次。</li>
		<li>将洗涤后的红细胞沉淀重悬于预冷的 0.25× PBS 中，孵育 30 分钟以诱导溶血。</li>
		<li>将裂解后的悬液在 20,000 × g 离心 30 分钟，分离游离血红蛋白，并收集 RBCM 沉淀。</li>
		<li>用 0.25× PBS 对收集的 RBCM 沉淀再洗涤三次，将呈淡粉色的 RBCM 沉淀储存于 −80 °C，待后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备一个孔径为 30 nm、直径为 13 mm 的聚醚砜（PES）膜。</li>
	<li>将 100 µL 浓度为 2%（w/v）的 RBCM 溶液滴加到 PES 膜的一侧，轻轻涂抹或逐滴分散，直至整个膜表面完全润湿。</li>
	<li>将膜在 50 °C 孵育 30 分钟，以确保均匀包被和干燥。</li>
	<li>将包被后的膜在室温下储存，并在制备后 15 天内使用17。 
	注意：RBCM 包被的 PES 膜的详细表征已在我们之前的研究中描述16。</li>
</ol>
3. SaliFilter 装置的制备（图1B）
<ol>
	<li>将RBCM包被的膜放入指定的滤器 holder 中。</li>
	<li>通过牢固连接进样端和出样端组件来组装装置。</li>
	<li>将一个1 mL注射器连接到装置的进样口。 
	注意：确保所有组件均紧密密封，以防止操作过程中发生泄漏。</li>
</ol>
4. 唾液预处理
<ol>
	<li>将500 µL唾液加入连接至SaliFilter装置的注射器中。</li>
	<li>施加轻柔的手动压力，使唾液样本通过膜（约2分钟）。</li>
	<li>从出口收集预处理后的唾液。</li>
	<li>立即使用预处理样本，或于4 °C保存直至进一步分析。</li>
</ol>
5. 唾液蛋白质的SDS-PAGE分析
<ol>
	<li>将15 µL样品与5 µL Laemmli上样缓冲液混合。</li>
	<li>将混合物加入8% SDS-PAGE凝胶的不同加样孔中。</li>
	<li>以150 V电泳40分钟。</li>
	<li>用考马斯亮蓝染色液染色2小时。</li>
	<li>用蒸馏水脱色过夜。</li>
	<li>使用智能手机或成像系统拍摄凝胶图像。</li>
</ol>
6. 使用侧向流动测定法（LFA）检测皮质醇
<ol>
	<li>将150 µL预处理后的唾液加入LFA试纸的样品垫上。</li>
	<li>让样品在试纸条上迁移10分钟。</li>
	<li>使用智能手机或成像系统拍摄检测结果的图像。</li>
	<li>在ImageJ中打开LFA图像，并使用图像 &#62; 颜色 &#62; 拆分通道，分离RGB通道。</li>
	<li>使用绿色通道图像进行检测线强度分析。</li>
	<li>选择一个100 × 10像素的矩形感兴趣区域（ROI），覆盖检测线，并将相同的ROI尺寸应用于所有试纸条图像。</li>
	<li>测量检测线ROI的平均强度值。选择相邻的空白膜区域，使用相同大小的ROI，测量背景强度。</li>
	<li>按下式计算归一化的检测线强度：归一化强度 = 检测线强度 − 背景强度。</li>
</ol>
7. 统计分析
<ol>
	<li>除非另有说明，定量数据以均值 ± 标准差（SD）表示。将误差线定义为 SD。 
	注：在本研究中，所有报告的 N 值均代表使用商业获取的混合人唾液等分试样进行的技术重复。</li>
	<li>使用从 0–8 ng mL−1 皮质醇浓度获得的归一化检测线强度值进行线性回归分析，并根据拟合曲线计算决定系数（R2）。</li>
	<li>使用以下公式计算检测限（LOD）：LOD = 3.3 × SE / |slope|，其中 SE 为线性回归方程中 y 轴截距的标准误差，|slope| 为斜率的绝对值。使用斜率的绝对值，因为竞争性 LFA 产生负斜率。 
	注：在本研究中，未进行推论性统计检验，也未应用显著性标准。</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

基于唾液的诊断技术为血液分析提供了一种无创替代方案。然而，由于唾液固有的黏稠性以及黏蛋白和蛋白质等干扰成分的存在，其广泛应用受到限制。这些因素会干扰毛细管驱动的流动，影响包括侧向流动分析（LFA）在内的简单分析平台的性能，因此需要有效的样本预处理方法。
本研究中，我们证明了所提出的手持式过滤装置 SaliFilter 能有效去除高分子量的干扰物质，同时保留皮质醇等小分子目标分析物。RBCM 涂层作为在 PES 膜上形成的生物来源界面层，有助于去除唾液中黏蛋白和蛋白质等高分子量组分。通过消除干扰流动的成分，该装置实现了唾液样本无需复杂或依赖仪器的预处理即可直接用于侧向流动检测（LFAs）。该发现凸显了样本预处理在连接原始生物样本与简化诊断平台之间的关键作用。
传统的样本预处理策略（如离心和稀释）在即时检测环境中存在固有局限性。离心需要实验室基础设施和多个处理步骤，而稀释会降低分析物浓度，影响分析灵敏度。相比之下，本方法可实现快速、无需设备的样本处理，同时保持分析物的完整性，从而改善毛细管流动并提高分析可靠性。我们先前的研究<su...

皮质醇是由肾上腺皮质分泌的一种糖皮质激素，是评估生理应激的关键生物标志物1,2。它可在多种生物液体中检测，包括血清、血浆、尿液、组织间液和唾液，其中血液和唾液在临床实践中最为常用3。尽管基于血液的检测可提供可靠的定量信息，但其需要侵入性静脉穿刺操作及专业人员参与，限制了其在频繁或长期监测中的适用性4,5,6。相比之下，唾液皮质醇检测是一种非侵入性且便捷的替代方法，适用于即时检测和自我监测应用7,8。值得注意的是，唾液中皮质醇水平与血液浓度具有高度相关性，支持唾液作为可靠的替代样本9。然而，唾液固有的黏稠性以及干扰成分的存在显著影响分析性能，因此在分析前需要有效的预处理步骤10,11,12。
已探索多种预处理策略以应对这些挑战。离心法被广泛用于去除黏蛋白、蛋白质和细胞碎片等大分子成分。然而，该方法需要使用体积庞大的实验设备并涉及多个处理步骤，限制了其在分散式检测环境中的应用13,14。使用缓冲溶液稀释可降低样本黏度并改善流动性能15。但该方法同时会降低待测物浓度，从而影响分析灵敏度。因此，现有方法仍不足以满足即时检测的需求，因为在即时检测中，快速、无需设备的样本处理以及目标待测物的有效保留至关重要。
为了克服这些局限性，我们开发了SaliFilter，这是一种用于唾液预处理的手持式装置，专为即时检测皮质醇而设计。该装置采用过滤机制，可选择性去除高分子量的干扰物质，同时允许包括皮质醇在内的小分子通过16。该装置通过手动操作，无需外部仪器即可实现快速、便捷的样本处理。通过去除干扰成分，该方法改善了侧向流动检测中的毛细管流动，从而提高了分析的可靠性。本实验方案详细描述了该装置的制备方法及其在侧向流动检测前用于快速唾液预处理的应用流程。

<table><tbody><tr><td>人工唾液</td><td>Solarbio, 中国</td><td>A7990</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad 蛋白检测试剂染料</td><td>Bio-Rad, 美国</td><td>5000006</td><td>用于 Bradford 法蛋白测定</td></tr><tr><td>考马斯亮蓝</td><td>Abcam, 英国</td><td>ab119211</td><td>用于蛋白条带显色</td></tr><tr><td>皮质醇 ELISA 试剂盒</td><td>Abcam, 英国</td><td>ab154996</td><td></td></tr><tr><td>皮质醇 LFA</td><td>本实验室自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热板</td><td>Daihan Scientific, 韩国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松（皮质醇）</td><td>Sigma-Aldrich, 美国</td><td>PHR1014</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli 样品缓冲液</td><td>GenDEPOT, 美国</td><td>L1200-001</td><td>用于 SDS-PAGE 前的蛋白变性</td></tr><tr><td>膜夹持器</td><td>GVS Filter Technology</td><td>1220950</td><td>直径 13 mm 的夹持器</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN&amp;reg; Tetra Cell（适用于 0.75 mm 胶）</td><td>Bio-Rad, 美国</td><td>1658000</td><td>用于凝胶电泳</td></tr><tr><td>黏蛋白</td><td>Sigma-Aldrich, 美国</td><td>M2378</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 分光光度计</td><td>Thermo Fisher Scientific, 美国</td><td></td><td>用于蛋白测定</td></tr><tr><td>PES 膜</td><td>STERLITECH, 美国</td><td>PES00313100</td><td>0.03 微米，13 mm PES 膜</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>DUKSAN, 韩国</td><td>LB004</td><td></td></tr><tr><td>混合人唾液</td><td>Innovative Research Inc., 美国</td><td>IRHUSL5ML</td><td></td></tr><tr><td>RBCM</td><td>本实验室自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAGE 分离胶缓冲液</td><td>Bio-Rad, 美国</td><td>1610798</td><td>用于分离胶的配制</td></tr><tr><td>Salivette 皮质醇采样管</td><td>SARSTEDT, 德国</td><td>51.1534.500</td><td>唾液采集套件</td></tr><tr><td>PAGE 浓缩胶缓冲液</td><td>Bio-Rad, 美国</td><td>1610799</td><td>用于浓缩胶的配制</td></tr><tr><td>Super&amp;bull;SAL&amp;trade;</td><td>Oasis Diagnostics, 美国</td><td>SSAL-601</td><td>唾液采集套件</td></tr><tr><td>注射器</td><td>koreavaccine, 韩国</td><td></td><td>1 mL 容量</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio-Rad, 美国</td><td>1610800</td><td>用于丙烯酰胺聚合</td></tr></tbody></table>

用于唾液预处理以提升皮质醇检测效果的手持设备

Handheld Device for Saliva Pretreatment to Improve Cortisol Detection

唾液皮质醇检测为基于血液的分析提供了一种无创替代方案。然而，由于唾液固有的黏稠性以及干扰成分的存在，其实际应用仍受到限制。特别是黏蛋白和唾液蛋白会阻碍毛细驱动流动，并影响后续侧向流动检测（LFAs）的可靠性，因此亟需有效且易于获取的前处理策略。本文介绍了一种用于即时检测皮质醇的手持式唾液前处理装置，称为SaliFilter。该装置采用过滤机制，可选择性去除高分子量的干扰成分，同时允许包括皮质醇在内的小分子通过。通过简单的手动加压操作，可在无需外部设备的情况下实现快速样本处理（约2分钟），适用于分散化检测场景。通过浊度测量、蛋白质定量和SDS-PAGE对装置性能进行了评估，结果证实其能高效去除黏蛋白和唾液蛋白。经处理的样本表现出增强的毛细流动性能，从而实现稳定可靠的侧向流动检测运行。定量分析显示信号重复性得到改善，在临床相关浓度范围内，皮质醇检测的检出限达到1.47 ng mL⁻1。本方案建立了一种有效的唾液前处理方法，在不破坏待测物完整性的前提下，提高了分析的灵敏度与可靠性。该方法为基于唾液的诊断提供了实用且便携的解决方案，在即时检测和自我监测方面具有广泛应用前景。

有效的唾液预处理需要去除会干扰下游分析性能的组分，包括黏蛋白和蛋白质。首先通过比较使用SaliFilter与商用唾液采集试剂盒处理后浊度的变化，来评估SaliFilter的过滤能力（图2A）。未经处理的唾液表现出较高的浊度，而经SaliFilter处理的样本明显澄清，表明其中的黏蛋白和悬浮成分被有效去除。相比之下，使用商用试剂盒处理的样本在澄清度上的改善有限。
通过测量280 nm处的吸光度定量评估蛋白质去除效果，结果显示过滤后蛋白质含量减少了约69%（图2B）。这一结果在Bradford法测定中得到进一步验证，经SaliFilter处理的样品颜色强度显著降低（图2C），对应总蛋白浓度减少约80%（图2D）。此外，SDS-PAGE分析显示处理后的样品中无可见蛋白条带，证实唾液蛋白被有效去除（图2E</st...

本方案描述了一种可提高皮质醇检测效果的快速唾液预处理方法。采用手持式过滤装置去除黏蛋白及其他干扰物质，同时保留目标分析物。经预处理的唾液具有更佳的毛细流动性能，从而实现更一致且可重复的检测结果。

唾液皮质醇检测为基于血液的分析提供了一种无创替代方法。然而，其实际应用仍受限于……

我们的研究重点是唾液预处理，以提高皮质醇检测的可靠性。该方案可应用于基于侧向流动分析法的唾液生物标志物检测。首先，在使用前轻轻混匀市售的去标识化混合人唾液样本，以确保其均匀性。将唾液样本储存在 4 摄氏度，并在供应商推荐的保存期限内使用。根据标准方案，解冻在 80 摄氏度下制备并储存的淡粉红色红细胞膜或 RBCM 沉淀物。准备一个孔径为 30 纳米、直径为 13 毫米的聚醚砜（PES）膜。取100微升2%（重量/体积）的RBCM溶液，滴加到PES膜的一侧。轻轻涂抹或逐滴加入溶液，直至整个膜表面完全润湿。将膜在50摄氏度下孵育30分钟，以确保均匀涂覆并干燥。将包被的膜在室温下保存，并在制备后15天内使用。为制备SaliFilter装置，将包被有RBCM的PES膜放入指定的滤器 holder 中。通过牢固连接进样口和出样口组件来组装装置。将1毫升注射器连接到设备入口。将500微升唾液装入连接至SaliFilter装置的注射器中。施加轻柔的手动压力，使唾液样本在约两分钟内通过膜。从出口收集预处理后的唾液，立即使用或在4°C下保存，直至进一步分析。通过SDS-PAGE检测蛋白质后，取150 µL预处理唾液加入LFA试纸条的样品垫上，用于皮质醇检测。让样品在试纸条上迁移10分钟。使用智能手机或成像系统拍摄检测结果的图像。将捕获的侧向层析试纸条（LFA）文件拖放到 ImageJ 软件窗口中。点击图像，选择颜色，然后选择“拆分通道”以分离红色、绿色和蓝色通道。关闭红色和蓝色通道，使用绿色通道图像进行检测线强度分析。使用矩形工具选择大小为100×10像素的感兴趣区域（ROI），覆盖检测线。打开其他LFA试纸条图像，并在所有样品中应用相同的ROI尺寸。单击“分析”并选择“测量”，以获取检测线 ROI 的平均强度值。接着，选择相同 ROI 大小的相邻空白膜区域，测量背景强度。将数值导出至 Excel 电子表格，并通过从检测线强度中减去背景强度来计算归一化的检测线强度。通过比较SaliFilter与市售唾液采集试剂盒在浊度变化方面的差异，评估其过滤能力，结果显示未经处理的唾液浊度较高，而经SaliFilter处理的样本明显澄清；使用市售试剂盒处理的样本仅在澄清度上表现出有限改善。通过280纳米处的吸光度对唾液蛋白进行定量，结果显示过滤后蛋白含量减少了约69%。Bradford 法检测显示，经 SaliFilter 处理的样品颜色强度显著降低，对应总蛋白浓度减少约 80%。毛细管流动分析表明，去除黏蛋白后，预处理唾液的流动性能得以恢复。SDS-PAGE 分析证实，黏蛋白被截留在膜上游，而在处理后的样品中不存在。 该方案可使研究人员在去除蛋白质和黏蛋白后检测游离皮质醇。过滤后，样品可通过SDS-PAGE、蛋白质测定、ELISA等方法进行分析。未来的研究可利用具有不同皮质醇浓度的临床唾液样本对该平台进行验证。

handheld-device-for-saliva-pretreatment-to-improve-cortisol-detection

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

用于提高皮质醇检测的唾液预处理手持设备

我们展示了以下内容：（1）由家庭护理人员在家庭环境中为认知功能受损的老年个体采集唾液样本的操作步骤；（2）通过唾液皮质醇和α-淀粉酶检测应激活动的操作步骤；（3）典型的检测结果图谱。这些使研究者能够探究与应激相关生理过程的实验方案，有助于加深我们对生物敏感性与易感性的理解。...

通过家庭照护者采集体弱社区居住老年人的唾液并测量唾液皮质醇和α-淀粉酶

皮质醇（CORT）会在人类和非人类灵长类动物毛发的生长期中逐渐累积。本文介绍了高精度、高灵敏度提取和分析毛发中CORT的方法。毛发中CORT的测定特别适用于评估数周至数月期间的慢性应激状态。...

从人类和猴毛发中提取和分析皮质醇

关于本科生学业成就情绪的研究主要依赖于实验室环境中的自我报告。很少有研究在这些自我报告中纳入生物生理学指标。本方案将描述一种方法，该方法结合自我报告与生物生理学测量，以评估学生在实验考试活动期间的反应与表现。...

利用皮肤电反应、唾液生物标志物和自我报告评估本科生在实验考试活动中的表现

本文介绍了一项研究方案，用于评估日常生活中音乐聆听与心理生理应激（通过主观应激水平、唾液皮质醇和唾液α-淀粉酶测定）之间的关联。文中提供了关于研究设计、材料、方法、受试者选择及统计分析的建议，并展示了代表性结果并进行讨论。...

评估日常生活中聆听音乐对心理生理应激的影响

头发皮质醇浓度分析为皮质醇的传统检测方法提供了一种替代方案；然而，科学家在采集非裔美国人头发样本时，需要具备文化敏感性和专业能力。本方案的目的是展示一种基于文化认知的技术，用于从非裔美国人中采集头发样本以进行皮质醇分析。...

在非裔美国人中采集头发样本以进行头发皮质醇分析

本文介绍了一种原创的混合方法，结合定量与定性分析，以准确评估参与者在特里尔社会应激测试及团体特里尔社会应激测试中的体验。...

具身现象学方法在特里尔社会应激测试中的应用：一种混合方法的视角

我们提出了一种用于确定从考拉毛发中提取皮质醇最佳溶剂的实验方案。本方案中使用的溶剂包括甲醇、乙醇和异丙醇。确定最佳提取溶剂将有助于可靠地测量毛发中的皮质醇水平，从而评估慢性应激对考拉的影响。...

考拉（Phascolarctos cinereus）毛发中皮质醇的测定

本文的目的是确定在访问三种不同环境后压力水平的变化，并描述基于唾液皮质醇、α-淀粉酶测量值以及心理自评量表来识别压力水平所使用的方法。...

测量访问三种不同自然程度地点后的生物物理与心理压力水平

本研究介绍了一种从鲟鱼物种的鳍和颌骨中提取皮质醇的实验方案。通过比较两种洗涤溶剂并结合酶联免疫吸附测定（ELISA），进一步检测了鳍和颌骨中的皮质醇水平。本研究初步验证了将颌骨皮质醇作为新型应激指标的可行性。...

从鲟鱼鳍和颌骨基质中提取皮质醇

设计了一项实验，用于研究考试经历对学生在高等教育环境和任务中所体验情绪状态的实时影响。该设计是跨学科（如教育心理学、生物学、生理学、工程学）和多模态（如唾液标志物、问卷调查、皮肤电反应传感器）方法相结合的成果。...

一种用于研究近实时真实考试体验的跨学科多模态实验设计

本方案展示了如何在猪一生的不同阶段，为其在板条地板饲养环境中提供切实有效的环境丰富化措施，以及如何以非侵入性方式采集唾液样本，用于检测皮质醇浓度，作为急性应激的生物标志物。...

为饲养在漏缝地板上的猪提供有意义的环境丰容并测量唾液皮质醇水平

112 次观看.  Kwangwoon University. 我们的研究重点是唾液预处理以提高皮质醇检测的可靠性。该协议可应用于使用横流免疫测定的基于唾液的生物标志物分析。首先，在使用之前轻轻混合商业获得的去标识的混合人类唾液样本以确保均匀性。将唾液样本存储在四摄氏度并在供应商建议的存储期限内使用。按照标准协议解冻淡粉红色红细胞膜或RBCM颗粒，该颗粒在80摄氏度下准备和存储。准备一个孔径为30?...

用于唾液预处理以提升皮质醇检测效果的手持设备

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