Name: DNA-FISH 中期染色体铺展法用于区分人类癌细胞系中的染色体外DNA与均匀染色区 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-04T13:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: 学习DNA-FISH中期染色体铺展法，在人类癌细胞系中区分染色体外DNA与均匀染色区。该方法可在单细胞分辨率下清晰可视化癌基因扩增状态，适用于无细胞遗传学专业背景的实验室。

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本研究工作获得了NIH R00HG011467和CPRIT RR23004对G.S.E.的资助。本项目的成像工作得到了贝勒医学院综合显微镜核心设施的支持，该设施的资金来自NIH（P30 DK056338、P30 CA125123、S10OD030414）。作者感谢Pawel Stankiewicz博士在项目早期提供的建议。作者还感谢斯坦福大学Paul Mischel博士提供了GBM39ec和GBM39hsr细胞系。

所有人类细胞培养操作均按照机构指南进行。
1. 使用秋水仙胺（N-甲基-N-去乙酰基秋水仙碱）将细胞阻滞于中期
<ol>
	<li>起始细胞数量约为 2.0 × 106–2.0 × 107 个癌细胞或其他培养细胞。细胞数量过少会导致中期分裂相减少，而细胞过多则可能导致固定不充分。</li>
	<li>确定实验体系所需的适当秋水仙胺（Colcemid）孵育时间。孵育时间会影响所获得中期分裂相的数量以及染色体长度，不同细胞类型的最适条件有所不同。 
	注意：较短的孵育时间会导致收集时处于中期停滞的细胞较少；较长的孵育时间会产生更浓缩且臂更短的染色体，增加分析难度。对于倍增时间约为 24 小时的癌细胞系，孵育 45 分钟至过夜可获得合适的中期分裂相。对于倍增时间较慢的细胞，应优化孵育时间。通常 2 小时的孵育即可产生足够数量的中期分裂相，且染色体长度适合分析。</li>
	<li>计算所需秋水仙胺（Colcemid）的用量，使其在适当的细胞培养基中达到终浓度 10 µL/mL。 
	注意：为保持细胞处于对数生长期，应在中期阻滞前至少 24 小时进行传代或接种。当细胞培养物达到 70%–90% 汇合度时，用秋水仙胺处理细胞。</li>
	<li>将秋水仙胺储存液用无菌超纯水按 1:1 比例稀释。加入适量体积至培养物中，并在细胞培养箱中孵育 45 分钟至过夜。</li>
</ol>
2. 收集细胞
<ol>
	<li>配制新鲜的卡诺固定液（甲醇:冰醋酸 = 3:1）。在整个固定过程中，将固定液置于冰上保存。</li>
	<li>配制新鲜的 0.075 M KCl 溶液，并在 37 °C 水浴中预热。</li>
	<li>将细胞离心成团并记录细胞数量。使用该数值计算最终重悬体积。 
	注意：贴壁细胞通过胰酶消化法解离。悬浮细胞直接转移至 15 mL 离心管中。根据机构的危险废物处理指南，妥善处置秋水仙胺及含秋水仙胺的培养基。</li>
	<li>用 PBS 清洗细胞。</li>
	<li>将细胞轻轻重悬于 10 mL 预热的 0.075 M KCl 溶液中，通过轻柔颠倒混匀。该低渗处理可使细胞膨胀，便于在制片过程中细胞破裂并释放染色体。</li>
	<li>在 37 °C 水浴中孵育 30 分钟。</li>
	<li>在轻柔颠倒混匀的同时，缓慢加入 2 mL 冰冷的卡诺固定液。</li>
	<li>静置细胞 5 分钟。</li>
	<li>在室温（RT）下以 500 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>小心吸除上清液，或用移液器移去。</li>
	<li>在每次加入后轻柔混匀的条件下，以每次 0.5 mL 的增量，缓慢加入共 10 mL 冰冷的卡诺固定液。</li>
	<li>在室温（RT）下静置 10 分钟。</li>
	<li>在室温（RT）下以 650 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>重复步骤 2.10–2.13 两次。</li>
	<li>在最后一次洗涤时，将细胞保留在卡诺固定液中悬浮。 
	暂停：可将固定的细胞悬液于 −20 °C 保存，或立即进入第 3 节操作。 
	注意：对于细胞数量少于约 3 × 106 的样本，应在 1.5 mL 微量离心管中进行固定，而非使用较大的锥形管。此时将 0.075 M KCl 和卡诺固定液的体积减少 10 倍，但保持所有孵育时间、温度及离心条件不变。</li>
</ol>
3. 台面落体实验
<ol>
	<li>从 −20 °C 取出样品，并将其解冻至室温。</li>
	<li>在室温下以 800 × g 离心 7 分钟。</li>
	<li>标记载玻片并将其放置在冰上。</li>
	<li>根据固定前获得的细胞计数，计算所需卡诺氏固定液的体积，以将细胞沉淀重悬至终浓度约为 5 × 106 个细胞/mL。离心后，用移液器小心吸除上清液，仅保留计算体积的固定液覆盖在沉淀上。</li>
	<li>使用 P1000 移液器将固定后的细胞在卡诺氏固定液中重悬。</li>
	<li>将约 300 µL 固定细胞悬液转移至 1.5 mL 微量离心管中。</li>
	<li>使用 P200 移液器通过反复吹打数次，充分重悬样本。</li>
	<li>使用 P200 移液器吸取 60 µL 重悬的细胞悬液。</li>
	<li>将移液器吸头置于冰上载玻片上方约 1 m 处，并对准载玻片中心。</li>
	<li>缓慢将一滴细胞悬液滴加到载玻片上。 
	注意：使用耐乙醇标记笔在载玻片边缘标记液滴位置，以便后续步骤中识别。</li>
	<li>让细胞在冰上干燥 10 分钟。</li>
	<li>将载玻片置于 80 °C 的玻片孵育器上孵育 10 分钟。</li>
	<li>用镊子取出载玻片，使其冷却至可触碰温度。</li>
	<li>使用相差显微镜配合 10× 或 20× 物镜检查载玻片。确认存在多个分散良好且无过度重叠的中期分裂相。</li>
</ol>
4. 预处理载玻片
<ol>
	<li>准备用于洗涤步骤的考普林瓶
	<ol>
		<li>每种试剂均需新鲜配制：70% 乙酸（40 mL）、PBS（40 mL）、PBS（45 mL）、70% 乙醇（40 mL）、85% 乙醇（40 mL）和 100% 乙醇（40 mL）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将玻片置于 70% 乙酸中 2 分钟。</li>
	<li>将玻片置于 40 mL PBS 中 30 秒。</li>
	<li>将玻片置于 45 mL PBS 中 5 分钟。</li>
	<li>依次在 70%、85% 和 100% 乙醇中各脱水 1 分钟。</li>
	<li>室温下晾干玻片 10 分钟。</li>
</ol>
5. 准备受体探针
注意：本方案使用市售的位点特异性 DNA-FISH 探针，该探针可与目标基因组区域杂交。
<ol>
	<li>选择一个靶向待检测扩增位点的探针。根据制造商说明书解冻探针和杂交缓冲液。使用前让探针恢复至室温。</li>
	<li>为每张玻片配制含有 1 µL 探针和 4 µL 杂交缓冲液的探针混合液。 
	注意：最佳探针浓度可能因制造商和探针而异。此处指定的浓度已根据本研究中所用探针进行优化。然而，针对每个新位点应优化探针浓度。</li>
	<li>将 5 µL 探针/杂交缓冲液混合物加至玻片上每个样品位点的中心位置。 
	注意：探针对光敏感。在整个后续操作过程中应尽量减少光照，步骤间或处理其他玻片时，将玻片存放于暗抽屉中。</li>
	<li>小心地将盖玻片覆盖在样品上。</li>
	<li>用橡胶胶水密封盖玻片边缘。</li>
	<li>将玻片放入湿盒中。</li>
	<li>根据制造商的操作规程进行探针杂交。杂交过夜（12–18 小时）。</li>
</ol>
6. 杂交后洗涤、复染、封片及成像
<ol>
	<li>准备用于洗涤步骤的考普林瓶
	<ol>
		<li>新鲜配制每种试剂：2× SSC（40 mL）、0.4× SSC（40 mL）、70% 乙醇（40 mL）、85% 乙醇（40 mL）、100% 乙醇（40 mL）和 PBS（45 mL）。</li>
		<li>将 SSC 配制成 20× 储存液（3 M NaCl，0.3 M 柠檬酸钠，pH 7.0）。配制 1 L 时，将 175.3 g NaCl 和 88.2 g 柠檬酸钠溶解于 1 L 超纯水中。根据需要将储存液稀释，以配制 2× SSC 和 0.4× SSC 工作液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 0.4× SSC 溶液在水浴中预热至 72 °C。</li>
	<li>从湿盒中取出玻片，并小心去除橡胶胶水。</li>
	<li>将玻片置于 2× SSC 中，在室温下孵育 2 分钟。小心移除盖玻片。</li>
	<li>将玻片放入预热至 72 °C 的 0.4× SSC 溶液中，孵育 2 分钟。</li>
	<li>将玻片置于 2× SSC 中，在室温下孵育 1 分钟。</li>
	<li>依次将玻片在 70%、85% 和 100% 乙醇中各脱水 1 分钟。</li>
	<li>在室温下避光空气中干燥 10 分钟。</li>
	<li>用 PBS 将 1 mg/mL DAPI 溶液按 1:1000 比例稀释至终体积 1 mL。 
	注意：此分装液可在 4 °C 保存最多 1 周。</li>
	<li>在每张玻片标记的液滴位置加入 10 µL 稀释后的 DAPI 溶液。</li>
	<li>小心地将盖玻片覆盖在样品上，确保 DAPI 溶液均匀铺展。</li>
	<li>在避光条件下孵育 5–10 分钟。</li>
	<li>将玻片放入 PBS 中 30 秒。</li>
	<li>移除盖玻片。</li>
	<li>将玻片放入 PBS 中 2 分钟。</li>
	<li>将玻片依次短暂浸入 70%、85% 和 100% 乙醇中进行脱水，每种浓度约 10 秒。</li>
	<li>在室温下避光空气中干燥 10 分钟。</li>
	<li>每张玻片上加入 15 µL 封片剂，然后盖上盖玻片。</li>
	<li>让封片剂均匀铺展，然后轻轻吸去多余液体。</li>
	<li>用指甲油密封盖玻片边缘。</li>
	<li>在室温下避光干燥指甲油 15 分钟。 
	暂停：长期保存时可将玻片存放于 4 °C。</li>
	<li>对玻片进行成像。 
	注意：图像使用倒置荧光显微镜配合 60× 油镜物镜采集。</li>
	<li>对每个荧光通道采集多个 z 轴层析图像，以完整捕获中期 spreads 全深度的信号。</li>
	<li>使用最大似然估计算法对图像堆栈进行去卷积处理，以增强信号清晰度并减少离焦荧光。</li>
	<li>在 ImageJ 中处理和分析最终图像，并在下游分析前为每个中期 spreads 选择最佳焦平面。</li>
</ol>

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作者声明无竞争利益。

尽管DNA-FISH中期染色体铺片技术具有明确的优势，但在全基因组测序（WGS）时代其应用仍显不足。扩增DNA的物理组织结构具有重要的功能意义，因其可能影响后续的生物学行为及治疗反应61,62,63,64。局灶性扩增的癌基因可存在于染色体外DNA（ecDNA）上或均染区（HSRs）内，而这两种扩增状态在功能上并不等同14,65,66,67。例如，靶向ecDNA上扩增基因的疗法可诱导细胞死亡，而转变为HSR状态的细胞则可能保持存活并表现出耐药性33,<sup cl...

人类基因组的组织不仅依赖于其序列，还依赖于其结构，而序列或结构的任何改变都可能导致癌症1,2,3,4。大约40%的肿瘤中存在癌基因扩增，这种情况可促进肿瘤的发生、生长、转移以及药物耐药性5。在某些情况下，扩增的癌基因位于染色体外DNA（ecDNA，也称为双微体）上，这些是存在于线性染色体之外的环状、可自我复制的双链DNA元件6,7,8,9。ecDNA的大小从数百千碱基到兆碱基不等10,11。由于缺乏着丝粒，ecDNA在有丝分裂过程中发生不对称分离，导致单个细胞核中可含有100多个拷贝12,13,14,15,16,17,18。这种不均等的分离在子代细胞间产生拷贝数变异，从而推动肿瘤的快速进化并导致患者预后不良17,19。
ecDNA 与均染区（HSR）之间存在动态关系（图 1A）8,18。HSR 是局灶性染色体内扩增结构，可通过 ecDNA 重新整合到基因组的单一基因座而形成8,10,18,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31。ecDNA 与 HSR 这两种状态可相互转化，表明癌基因扩增在结构上具有可塑性24,25,32,33。这种相互转化具有治疗相关性，因为在药物存在的情况下，ecDNA 可转变为 HSR 状态32,33,34,35,36,37,38。发生此种向 HSR 状态转化的细胞在治疗压力下会对药物产生耐药性33。此外，HSR 在恶性肿瘤中的出现频率似乎高于良性肿瘤39。尽管 HSR 具有临床相关性，目前尚无经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的靶向 HSR 状态的治疗策略，部分原因在于用于区分这些扩增结构的方法仍未得到充分应用。
尽管ecDNA和HSR状态具有不同的临床后果，但目前的测序方法无法可靠地区分二者。全基因组测序（WGS）现已能够以碱基对分辨率识别扩增区域40。WGS在定义ecDNA和HSR的序列组成方面具有重要价值，但牺牲了空间分辨率。与传统的细胞遗传学方法不同，仅靠WGS无法确定扩增序列是位于ecDNA上，还是作为HSR整合到染色体中41,42,43。因此，保留扩增空间背景的方法对于理解这两种不同状态的生物学仍至关重要。
近40年来，DNA荧光原位杂交（DNA-FISH）中期铺展技术一直是识别和区分染色体外DNA（ecDNA）与均质染色区（HSR）扩增状态的金标准42,44,45,46。事实上，ecDNA和HSR最初正是通过基于中期相的细胞遗传学分析得以发现和表征的7,47。在荧光探针广泛应用之前，原位杂交采用放射性标记的DNA探针进行，这些探针也曾用于可视化ecDNA和HSR48,49。随着全基因组测序（WGS）的普及，DNA-FISH中期铺展技术的使用逐渐减少。该实验流程的诸多细节分散于细胞遗传学文献中，而优化后的实验方案通常由个别研究团队或细胞遗传学实验室内部保留，并被视为专有技术50,51。本文中，我们描述了一种DNA-FISH中期铺展实验方案，可在单细胞水平上直观解析基因扩增状态。

<table><tbody><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>任何来源</td><td>NA</td><td>离心&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>15 mL 一次性离心管</td><td>任何来源</td><td>NA</td><td>细胞收集。</td></tr><tr><td>200 proof 乙醇</td><td>任何来源</td><td>NA</td><td>洗涤步骤。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>乙酸，冰醋酸，99.7%</td><td>默克生命科学</td><td>695092</td><td>卡诺固定液和玻片洗涤步骤。</td></tr><tr><td>抗荧光淬灭封片剂</td><td>FisherScientific</td><td>NC9265087</td><td>完成载玻片制备后的封片</td></tr><tr><td>带有真空出口的生物安全柜</td><td>任何来源</td><td>NA</td><td>化学品储存</td></tr><tr><td>秋水仙酰胺（N-甲基-N-脱乙酰秋水仙碱）</td><td>Millipore Sigma</td><td>10295892001</td><td>结合微管蛋白，使细胞停滞于中期。</td></tr><tr><td>考普林罐</td><td>任何来源</td><td>NA</td><td>洗涤步骤。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI（4&amp;prime;,6-二脒基-2-苯基吲哚）</td><td>默克密理博</td><td>D8417-1MG</td><td>荧光DNA染料</td></tr><tr><td>EGFR/CON7 FISH 探针&amp;nbsp;</td><td>Empire Genomics</td><td>EGFR-CHR07</td><td>位点特异性荧光&amp;nbsp;探针&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Elmer's 橡胶胶水</td><td>任何来源</td><td>NA</td><td>过夜探针杂交期间保持盖玻片位置不变。</td></tr><tr><td>乙醇耐受性永久记号笔</td><td>任何来源</td><td>NA</td><td>载玻片标记。</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>任何来源</td><td>NA</td><td>载玻片成像。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>玻璃盖玻片，22 × 22 mm</td><td>ThermoFisher</td><td>50-143-780</td><td>载玻片上的探针杂交。</td></tr><tr><td>预清洁载玻片</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td>滴加中期分裂相并进行DNA-FISH。</td></tr><tr><td>加湿式CO2培养箱</td><td>任何来源</td><td>NA</td><td>活细胞孵育。</td></tr><tr><td>杂交缓冲液</td><td>Empire Genomics</td><td>杂交缓冲液</td><td>与探针配合使用的缓冲液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>冰桶</td><td>任何来源</td><td>NA</td><td>保持卡诺固定液处于低温状态。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>KCl (2 M)</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9640G</td><td>在固定前使细胞膨胀。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>甲醇，99.9%，HPLC 级</td><td>默克生命科学</td><td>1060351000</td><td>用于卡诺固定液。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>微型离心机</td><td>任何来源</td><td>NA</td><td>离心&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>任何来源</td><td>NA</td><td>用于细胞固定及探针制备。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MYC / SE 8 探针</td><td>Leica</td><td>KI-10106</td><td>位点特异性荧光&amp;nbsp;探针&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PBS，pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>洗涤步骤。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>相差显微镜</td><td>任何来源</td><td>NA</td><td>滴片后立即进行中期染色体铺展成像</td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>任何来源</td><td>NA</td><td>移液</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9888</td><td>用于 SSC 缓冲液。</td></tr><tr><td>柠檬酸钠</td><td>Millipore Sigma</td><td>567446</td><td>用于 SSC 缓冲液。</td></tr><tr><td>无菌超纯水</td><td>任何来源</td><td>NA</td><td>洗涤步骤。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ThermoBrite 可编程载片孵育仪</td><td>任何来源</td><td>NA</td><td>孵育载玻片。</td></tr><tr><td>镊子</td><td>任何来源</td><td>NA</td><td>用于玻片洗涤步骤。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>任何来源</td><td>NA</td><td>用于KCl孵育。&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

dna-fish 中期染色体铺展法用于区分人类癌细胞系中的染色体外dna与均匀染色区

DNA-FISH Metaphase Spreads to Distinguish Extrachromosomal DNA from Homogeneously Staining Regions in Human Cancer Cell Lines

全基因组测序能够以单碱基对分辨率识别局灶性DNA扩增，但无法确定扩增序列位于染色体外DNA（ecDNA，也称为双微体）还是染色体内整合的均一染色区（HSR）中。DNA荧光原位杂交（DNA-FISH）中期染色体铺片技术仍是单细胞分辨率下区分这两种扩增状态的金标准。本文提供了一套使用人源癌细胞系进行DNA-FISH中期染色体铺片的详细实验方案，涵盖细胞培养、中期阻滞、低渗处理、固定、染色体铺展、荧光探针杂交及荧光成像等步骤。该方案包含多个中间质量控制环节，用于验证染色体分散效果并优化中期铺片质量，使无特殊细胞遗传学经验的实验室亦可顺利实施。实验结果展示了利用位点特异性探针对ecDNA和HSR扩增状态的清晰可视化，并呈现了可能影响结果判读的常见技术假象。本方案为研究癌基因扩增在癌细胞中的结构组织提供了可靠且可重复的技术路径。

该实验方案（图1B）可获得清洁、分散良好且完整的中期染色体，适用于细胞遗传学分析，染色体及DNA-FISH信号可通过荧光显微镜清晰观察。使用明场/相差显微镜在低倍镜（10×或20×）下观察是重要的质量控制步骤，用于确认细胞核已破裂且染色体已充分分散（图2）。成功的固定和台面滴片操作应产生分散良好的中期染色体 spreads，并在载玻片上呈现多个可见的染色体破裂区域。高质量中期 spreads 的得率因细胞系而异，同时也受秋水仙胺（Colcemid）处理时间的影响。作为一般参考标准，成功的制备通常在使用20×物镜观察时，每视野可获得约3–5个处于中期分裂且发生破裂的细胞52。质量不佳的中期 spreads 常表现为细胞聚集、破裂细胞核比例偏低和/或染色体分散不良，这些因素均会干扰后续的结果判读。
代表性DNA-FISH中期染色体铺展图像展示了ecDNA和HSR扩增状态，如图3<...

我们报告了一种DNA-FISH中期染色体铺展实验方案，可直观检测基因组内特定基因座的拷贝数及其位置。该方法能够以单细胞分辨率解析扩增状态，特别适用于含有染色体外DNA和均一染色区的癌细胞系。

DNA-FISH 中期染色体铺展法用于区分人类癌细胞系中的染色体外DNA与均匀染色区

全基因组测序可识别具有碱基对分辨率的局灶性DNA扩增，但无法确定扩增的序列是否位于染色体上……

我们的研究重点是确定扩增的癌基因是位于染色体外DNA上，还是位于染色体内部特定的均一染色区（HSR）中。测序技术无法区分染色体外DNA（ecDNA）与HSR扩增，因此本方案可在单细胞分辨率下解决这一问题。首先，将秋水仙素储备液与无菌超纯水按1:1比例稀释。为实现中期阻滞，向处于对数生长期、融合度为70%至90%的10毫升培养基中的COLO320DM细胞加入100微升稀释后的秋水仙素溶液，并将细胞置于细胞培养箱中孵育45分钟至过夜。使用甲醇与冰醋酸按3:1比例新鲜配制卡诺氏固定液。在整个固定过程中，将卡诺氏固定液置于冰上保存。新鲜配制0.075摩尔/升的氯化钾溶液，并将其在37摄氏度水浴中预热。离心并计数细胞后，用PBS洗涤细胞。轻柔地将细胞重悬于10毫升预热的0.075摩尔/升氯化钾溶液中，并通过轻柔翻转混匀细胞悬液。将细胞在37摄氏度水浴中孵育30分钟。在轻柔翻转混匀的同时，缓慢加入2毫升冰冻的卡诺氏固定液。静置5分钟后，在室温下以500 × g离心5分钟。使用移液器小心吸除上清液。以每次0.5毫升的增量，缓慢加入共10毫升的冰冻卡诺氏固定液，每次加入后轻柔混匀悬液，并静置10分钟。在室温下以650 × g离心5分钟。在最后一次洗涤过程中，使细胞保持悬浮于卡诺氏固定液中。标记载玻片并将其放置在冰上。使用 P1000 移液器将细胞重悬，浓度约为每毫升 Carnoy 固定液含 500 万个细胞。取约 300 微升固定后的细胞悬液转移至 1.5 毫升微量离心管中。使用 P200 移液器通过反复吹打数次充分重悬样本。吸取 60 微升重悬的细胞，将移液器枪头举至距载玻片约 1 米高处，对准冰上载玻片的中心位置，缓慢将细胞悬液滴加到载玻片上。将载玻片置于 80 摄氏度的玻片孵育器中孵育 10 分钟。使用 10 倍或 20 倍物镜的相差显微镜观察玻片。确认存在多个分散良好、重叠极少的中期分裂相。进行玻片预处理时，将玻片置于70%乙酸中2分钟。用40毫升PBS洗涤30秒，随后再用45毫升PBS洗涤5分钟。接着，依次将玻片在70%、85%和100%乙醇中各脱水1分钟。在玻片上每个点样位置的中央加入5微升探针与杂交缓冲液的混合液（含1微升扩增的位点特异性探针和4微升缓冲液）。小心地将盖玻片覆盖在样本上，并用橡胶胶水密封边缘。根据制造商说明书的要求，将玻片置于湿盒中进行原位探针杂交，孵育12至18小时。从湿盒中取出玻片，小心去除橡胶胶水。将玻片置于2×SSC溶液中，室温孵育2分钟，然后小心移去盖玻片。接着将玻片放入预热至72摄氏度的0.4×SSC溶液中孵育2分钟，随后在室温下置于2×SSC溶液中1分钟。依次将玻片在70%、85%和100%乙醇中各浸泡1分钟进行脱水。将玻片置于室温避光处晾干10分钟。用移液器将10 µL稀释后的DAPI溶液滴加到每张载玻片的指定位置。小心地将盖玻

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科研

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生物学

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