Name: 简单且易于操作的卵孵化检测方法 秀丽隐杆线虫可变格式的药物筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-03T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 学习使用三种可配置的秀丽隐杆线虫卵孵化检测方法进行药物筛选与发育生物学研究。该平台操作简便、成本低廉，适用于抗寄生虫药物发现、毒理学评估及教学实验室场景。

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本研究由布宜诺斯艾利斯国立大学（Universidad Nacional del Sur，项目编号PGI 24/B366，授予GH）资助。我们感谢WormBase（https://wormbase.org）。菌株由秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis）遗传中心（CGC）提供，该中心由美国国立卫生研究院研究基础设施项目办公室（NIH Office of Research Infrastructure Programs，资助号P40 OD010440）资助。

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作者声明本文内容不存在利益冲突。

本研究提出了一种针对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的简单且可适应的卵孵化检测平台，该平台基于三种互补的实验形式，分别在控制性、暴露动态和可扩展性方面有所不同。我们的结果支持这样一种观点：卵孵化检测应被视为一种灵活的方法学框架，可根据特定的实验目标进行调整，而非定义单一的最优方案。
基于微量离心管的实验体系为药物暴露提供了高度可控的环境，能够精确定义孵育时间、化合物浓度以及洗涤步骤。该配置特别适用于定量药理学分析和机制研究，因为它能够将暴露阶段与后续发育阶段分离开来。采用此体系获得的IC50值（0.19 mM）反映了这些受控条件，其中化合物暴露时间受限，并在孵化前通过洗涤步骤降低残留药物水平。该设计最大限度地减少了因长期暴露带来的干扰效应，并有利于后续应用，例如将幼虫转移至接种细菌的培养板，以进一步评估其运动能力、生长情况或发育进程。类似地，将暴露阶段与恢复阶段分离的方法此前已在C. elegans药理学检测中得到应用19,<s...

卵孵化实验（EHA）长期以来一直是线虫学中评估化学化合物杀卵活性及早期发育影响的核心方法。该方法最初为寄生性线虫设计，用于在受控条件下定量分析胚胎发育或幼虫孵化的抑制情况 体外 条件，提供诸如孵化率或浓度-反应分析（如EC）等稳健且具有生物学意义的终点指标50 或 IC50)1,2,3,4,5,6,7.
在捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）和蛇形毛圆线虫（Trichostrongylus colubriformis）等寄生性线虫中，传统的基于虫卵的研究方法已被广泛用于评估合成药物和天然产物的驱虫效果，并监测抗驱虫药耐药性1,2,6,8,9,10。这些方法涵盖多种检测指标，从直接评估虫卵活力和孵化率，到检测粪便培养后幼虫的发育情况。总体而言，这些方法在关联药物暴露与寄生虫繁殖能力及传播潜力方面发挥了核心作用。然而，这些方法通常需要从感染宿主中进行复杂的样本制备，较长的孵育周期，以及专业的实验设施，这可能限制其可及性、可扩展性以及实验室间的可重复性。
秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）作为模式生物的应用已成为克服寄生性线虫研究中多种局限性的有力策略。其生命周期短、遗传操作简便、易于培养，且与寄生性物种共享关键的分子靶点，因此特别适用于药理学、毒理学和发育学研究。重要的是，C. elegans 的胚胎发育迅速且高度可重复，使得卵存活率和孵化实验可作为早期发育过程及其受外源物质干扰情况的定量且可靠的检测指标11,12,13,14,15,16,17。
此外，已有大量特征明确的突变菌株可供使用，这有助于深入理解药物作用及耐药的机制。先前的研究表明，对生物活性化合物的耐药性可能以发育阶段依赖的方式产生，胚胎期和幼虫期表现出不同的敏感性。例如，谷氨酸能信号通路的改变与幼虫耐药表型相关，而卵的孵化则不受影响14,18,19,20。这凸显了药物敏感性的阶段特异性，提示胚胎期可能涉及与后期发育阶段不同的作用靶点或药物可及性的差异。
除了寄生虫学领域外，C. elegans 的卵存活率检测在毒理学和早期药物发现中也日益重要。这些检测不仅用于评估驱虫活性，还用于评价发育毒性以及药物诱导的胚胎缺陷，其结果可能与高等生物的毒性特征相关15,16。与此同时，卵壳的存在引入了重要的生物学限制，因其作为包围胚胎的保护性且具有选择性通透性的屏障21,22。因此，某些生物活性分子可能无法到达胚胎，即使其在后续发育阶段表现出活性14,19,23,24。化合物进入胚胎的可能性因而可能取决于其各自的理化性质，包括分子大小和极性。这可能导致卵孵化检测中的活性结果与后续发育阶段的活性结果之间存在差异。这一区别凸显了明确定义实验条件以及所测量生物学终点的重要性。
从方法学上讲，秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的卵孵化实验已采用多种实验形式，包括同步化卵的液体培养、直接暴露于含药物的琼脂平板，以及适用于中高通量筛选的多孔板实验11,13,14,16,19,23,24。
基于液体和微孔板的方法已广泛应用于药理学筛选研究，因为它们能够提供均一的暴露条件，便于精确控制药物浓度，并可对浓度-反应关系进行定量分析。与此同时，针对寄生性线虫，类似的多孔板策略也得到了广泛发展，从传统的96孔板检测到采用384孔格式的超高通量平台均有涉及4,5。这些方法共同凸显了卵孵化检测在不同线虫物种中的多功能性和可扩展性，以及其在从小规模机制研究到大规模化合物筛选等多种实验条件下的适应能力。
不同实验体系在实验控制性、可重复性、通量和可及性方面具有各自的优势与局限性。基于液体的检测方法可提供均一的暴露条件，适用于定量药理学分析；而基于琼脂的检测方法可在整个发育过程中实现持续暴露，但会因药物扩散和生物利用度问题引入变异性。多孔板格式则能够实现并行操作并减少试剂消耗，符合现代筛选策略的要求。
尽管广泛使用，卵孵化实验通常被描述为固定的操作流程，而非一种灵活的方法学框架。不同实验形式之间的直接比较十分有限，而在从机制研究到高通量筛选或教学环境等特定应用场景中，如何选择最合适实验配置的指导也仍然不足。
本研究提出了一种简单、易行且可灵活调整的平台，用于秀丽隐杆线虫（C. elegans）的卵孵化实验，整合并比较了三种实验方案：（i）在微量离心管中进行受控孵育，随后接种至琼脂平板；（ii）直接暴露于含药物的琼脂平板；（iii）基于多孔板的液体实验体系。
通过系统评估这些实验条件，我们旨在建立一个实用的框架，以阐明实验控制性、操作简便性和可扩展性之间的权衡关系。这种整合性视角将经典的寄生虫学方法与现代基于模型的筛选技术相结合，使虫卵孵化实验不再局限于一种单一的标准化技术，而是成为一个可适应多种研究场景的多功能平台，包括驱虫药物发现、毒理学评估、发育生物学研究以及教学应用。

<table><tbody><tr><td>细菌学琼脂</td><td>不列颠尼亚&amp;nbsp;</td><td>B0101406</td><td>应新鲜配制（1.7 克溶于 100 毫升）&amp;nbsp;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>漂白剂溶液</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>1.2 % (v/v) NaOH 和 0.5 M NaOH</td></tr><tr><td>离心</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>Sorvall ST16R&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>BiofugePICO 转移至离心管</td><td>Heraeus 75003235&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>数码相机</td><td>ToupCam&amp;nbsp;</td><td>TP605100A</td><td>工业数字相机，可调焦距 USB 2.0</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>BioBasic&amp;nbsp;</td><td>RAS#7-68-5</td><td>分子量：78.13</td></tr><tr><td>乙酸芳樟酯&amp;nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>CAS号：115-95-7</td><td>应新鲜配制</td></tr><tr><td>LB 培养基</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>10 g 胰蛋白胨，5 g 酵母提取物，10 g NaCl，加去离子水至 1 L&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>M9 缓冲液&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>3 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，6 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，5 g&amp;nbsp; NaCl，0.25 g MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 至1 L蒸馏水</td></tr><tr><td>小型旋转仪 &amp;nbsp;</td><td>BioSan</td><td>Bio RS-24</td><td></td></tr><tr><td>线虫生长培养基（NGM）</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>3 g NaCl，17 g 琼脂，2.5 g&amp;nbsp; 将Bacto-Peptone加入1 L蒸馏水中，高压灭菌。添加1 mL胆固醇（5 mg/mL）。&amp;nbsp; 1 mL CaCl₂ (1 M)、25 mL 磷酸钾缓冲液 (1 M, pH 6.0) 和 1 mL&amp;nbsp; MgSO4 (1 M)</td></tr><tr><td>培养皿（3 - 5 mm）</td><td>ThermoScientific. Nunclon Delta 表面&amp;nbsp;</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（90 mm × 15 mm）</td><td>ExtraGene&amp;nbsp;</td><td>1026160305</td><td>仅限实验室使用，聚苯乙烯。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>移液器</td><td>Fisherbrand</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>SigmaPlot 12.0</td><td>Systat Software</td><td>N/A</td><td>版本 12.0</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>ARCANO</td><td>ZTX-T 1:4 LED</td><td>三目体视显微镜（10×）&amp;ndash;40倍总放大倍数；LED透射与反射照明</td></tr><tr><td>蔗糖&amp;nbsp;</td><td>Cicarelli 实验室&amp;nbsp;</td><td>艺术 841</td><td>60 %（v/v）蔗糖&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>96 孔组织培养板&amp;nbsp;</td><td>生物膜&amp;nbsp;</td><td>TCP 012096</td><td>聚苯乙烯，低蒸发盖。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ToupView&amp;nbsp;</td><td>图普科技</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>反式肉桂醛（TCA）</td><td>Santa Cruz Biotechnology&amp;nbsp;</td><td>J1712</td><td>应新鲜配制</td></tr></tbody></table>

简单且易于操作的卵孵化检测方法 秀丽隐杆线虫可变格式的药物筛选

Simple and Accessible Egg-Hatching Assays in Caenorhabditis elegans: Adaptable Formats for Drug Screening

卵孵化实验（EHA）被广泛用于评估化学化合物对线虫早期发育阶段的影响，尤其在驱虫药物研究中具有重要应用。然而，现有的方法在形式、复杂性和可重复性方面存在显著差异，且通常以固定实验方案的形式呈现，而非可灵活调整的实验框架。本研究通过整合并直接比较三种实验配置，建立了一种针对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的简单、易操作且灵活的卵孵化实验平台：（i）在微量离心管中进行受控孵育，随后接种至琼脂平板；（ii）在含药物的琼脂平板上直接暴露处理；（iii）基于多孔板的液体实验体系。实验中采用两种代表性化合物以展示该方法的应用效果：一种可抑制卵的孵化，另一种则无明显可检测的作用。每种配置在实验控制性、通量和可及性方面均具有独特优势。基于微量离心管的方法可实现对药物暴露的精确控制，适用于定量药理学分析；基于琼脂的实验方法操作简便、成本低廉，适合持续暴露处理及教学环境；多孔板格式则支持可扩展、标准化的高通量筛选，符合现代药物发现流程的需求。通过对这些格式的直接比较，我们阐明了方法学选择如何影响实验的可重复性、药物暴露动力学以及生物学结果的解读，尤其涉及特定发育阶段的相关因素，例如卵壳的保护作用以及分子靶点表达在发育过程中的变异。总体而言，本研究确立了秀丽隐杆线虫（C. elegans）卵孵化实验作为一种多功能且可扩展的实验平台，可适应多种应用场景，包括驱虫药物筛选、毒理学评估、发育生物学研究以及教学实验，从而促进该方法更广泛且更合理的使用。

TCA在所有实验条件下均表现出明显的浓度依赖性抑制卵孵化作用，如图1所示。每种检测配置的代表性浓度-反应曲线分别展示如下：微量离心管（图1A）、在琼脂平板上的直接暴露（图1B）以及多孔板（图1C）。
在微量离心管中测得的IC₅₀值为0.19 ± 0.0262 mM，在琼脂平板上为0.1758 ± 0.0463 mM，在多孔板中为0.2267 ± 0.0093 mM。这些数值作为每种检测方法所获得的浓度-反应关系的代表性示例展示。尽管观察到一些微小差异，但所有数值均落在相对较窄的范围内，表明不同实验配置之间具有整体一致性。重要的是，化合物特异性的反应可能随其理化性质和检测条件而变化；因此，这些数值不应被解释为在所有检测格式中对活性具有普遍预测性。
对照条件（水和DMSO）在所有实验条件下孵化率...

本研究介绍了一种在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中灵活且标准化的卵孵化检测平台，该平台整合了多种实验形式。该方法提高了实验的可重复性、可扩展性和可及性，能够有效评估药物效应和发育过程，同时具备成本低、易于适应科研应用和教学环境的优点。

卵孵化实验（EHA）被广泛用于评估化学化合物对线虫早期发育阶段的影响，特别是在...

我们开发了简单且可扩展的秀丽隐杆线虫（C. elegans）卵孵化实验，用于评估化合物对胚胎发育的影响。现有方法缺乏标准化且可适应的实验流程。本方案提供了一种可扩展且标准化的方法，适用于低通量和高通量筛选。从三到五个含有大量成年雌性线虫的线虫生长培养基平板开始。选择含有大量产卵成虫且可见卵子的平板，表明其具有活跃的繁殖能力。向每个平板中加入蒸馏水，轻柔地将线虫转移至15毫升锥形管中。避免刮取琼脂表面，以尽量减少杂质。在266 ×g下离心3分钟使线虫沉淀，弃去含细菌的上清液，并重复洗涤步骤三次。为分离卵子，将线虫沉淀重悬于新鲜配制的漂白液中。剧烈振荡试管，以促进成虫体壁破裂并释放卵子。孵育时间不得超过5分钟。在显微镜下确认成虫体基本被破坏而卵子保持完整。密切监测反应过程，并在5分钟后加入冷的无菌蒸馏水至终体积14毫升，以终止反应并防止卵子受损。盖紧管盖后轻轻倒置数次，迅速稀释漂白液，以维持卵子的活力。随后在266 ×g下离心3分钟，小心弃去上清液。用无菌蒸馏水将卵沉淀洗涤三次，彻底去除残留漂白剂，每次洗涤之间确保充分重悬。然后，将卵子重悬于5毫升60%蔗糖溶液与5毫升蒸馏水的混合液中。在266 ×g下离心5分钟后，从蔗糖梯度环处收集卵子，并用无菌水洗涤。再次离心试管，弃去上清液，将卵子重悬于5毫升M9缓冲液或无菌水中。制备卵子储备液时，取样前需轻轻混匀卵子悬液，因为卵子会快速沉降。随后，在载玻片上放置三滴20 µL的卵液，在体视显微镜下计数卵子数量。使用M9缓冲液将浓度调整为每100 µL含50至100个卵子。分装前充分混匀卵子悬液，以确保均一性。然后根据所选实验方案，为每种实验条件分装所需体积的卵子悬液。通过将1.7克琼脂加入100毫升蒸馏水中（不添加营养物质或细菌）制备无药物琼脂平板。将约3毫升琼脂溶液倒入每个35毫米的培养皿中，以确保实验间琼脂厚度一致。在使用前12至24小时制备琼脂平板，以防止过度干燥，过度干燥会降低卵的存活率并影响幼虫运动。琼脂凝固后，将每个平板划分为四个象限，以便计数。将平板密封后储存在8至10摄氏度条件下，以防脱水。接下来，轻轻混匀卵悬浮液，并为每种条件取500微升卵悬浮液转移至1.5毫升微量离心管中。向500微升卵悬浮液中加入500微升反式肉桂醛处理溶液或相应的对照溶液。在22摄氏度下孵育4至8小时。孵育期间，使用管式旋转仪或摇床保持轻柔振荡，以防止卵沉降并确保暴露均匀。避免静置，以防药物暴露不均。在离心前标记每根离心管的一侧，以便快速定位沉淀并防止在移除上清液时意外丢失。孵育结束后，在18至25摄氏度下以3420 ×g离心3分钟。沉淀物表现为管壁上的微小白点。小心移除上清液，避免扰动沉淀物，然后将最终沉淀物重悬于240微升M9缓冲液中。使用前让琼脂平板平衡至室温。通过将20微升悬浮液点样到每个象限中，将悬浮液接种至琼脂平板上。

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生物学

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