Name: 以福利为导向的小鼠给药与采血人工固定技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-25T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: 学习使用应用隧道对小鼠进行福利导向的固定技术，用于腹腔注射、静脉注射及采血等常规实验操作。该方法可显著减少急性应激反应，提升动物福利水平，并有助于获得更可靠的实验数据。

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感谢我们的柏林大学动物设施工作人员和动物福利官员，特别是 André Dülsner 博士，感谢他们提供的支持；感谢柏林大学 3R 为推广应用隧道提供的资金支持；感谢柏林大学 3R 优化工作组的所有成员，感谢他们有益的讨论。

本方案中描述的所有操作均经主管地方当局（柏林州卫生与社会事务办公室（LAGeSo）；批准编号 2022-077-G）审查并批准，并遵循 ARRIVE 2.0 指南进行。本研究中使用的所有材料均列于材料表中。
1. 静脉注射给药
注意：本方法描述了一种以动物福利为导向的小鼠静脉注射手动保定技术。静脉注射操作仅可由经过培训的人员在遵守机构指南以及既定的安全与卫生规程的前提下进行。
<ol>
	<li>动物准备 
	注意：在处理动物时，应始终根据机构的生物安全与卫生要求穿戴必要的个人防护装备（PPE）（例如，实验服、手套、头帽、口罩）。
	<ol>
		<li>将饲养笼置于红灯下照射10–15分钟，以促进血管扩张，提高尾静脉的可见度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>工作区域准备
	<ol>
		<li>用70%乙醇清洁施用隧道，待乙醇完全挥发约5分钟。</li>
		<li>将一块清洗并经高压灭菌的垫料（将Vetbed Isobed裁剪至所需尺寸）卷成筒状，放入隧道内（图1B）。</li>
		<li>用手指轻轻按压隧道入口处的垫料，使剩余开口宽度约为两个相邻手指并拢的宽度。切勿进一步压缩垫料。</li>
		<li>将施用隧道放置在工作台面上，并在隧道入口前方放置另一块平整的垫料。</li>
		<li>准备好装有27G针头、含所需注射液的注射器，并将其放置在隧道旁。确保棉签和消毒喷雾剂易于取用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以动物福利为导向的隧道固定法
	<ol>
		<li>使用抓取管将小鼠从饲养笼中转移。</li>
		<li>将抓取管直接置于施用隧道开口前方，使小鼠自愿进入隧道（图1C）。 
		注意：部分小鼠倾向于先踏上施用隧道前方的垫料，再自愿进入隧道。可通过轻握尾根部防止小鼠在隧道内深入移动或转身。</li>
		<li>小鼠进入后，通常会保持在卷状垫料内且不转身。 
		注意：若小鼠不愿进入隧道，可能是开口过小；可轻微压缩隧道入口处的垫料。若小鼠体型过小且易转身，可收紧卷状垫料或增加一层垫料（图1B）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>静脉注射 
	注意：静脉注射采用常规成熟的尾静脉注射方法进行。
	<ol>
		<li>握住尾尖轻轻拉直尾巴，并对预定注射部位进行消毒。将尾巴旋转约90°，使侧尾静脉位于背侧。</li>
		<li>从尾部远端开始注射，以便必要时可在更近端位置重复尝试。 
		关键步骤：将针头以相对于尾巴约15–20°的角度刺入，保持针头几乎与尾巴平行。进针深度仅需略超过针尖斜面，因尾静脉位置表浅。正确的针头位置表现为注射时阻力极小，且可见注射液在静脉内流动。以缓慢、稳定的速度注射所需体积（≤5 mL/kg，持续13秒）。拔针后，用无菌棉签轻压注射部位以防止出血。 
		注意：使用后的针头/注射器应立即放入防穿刺、防泄漏的锐器盒中。切勿尝试回套针帽，以防针刺伤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>释放与正向强化
	<ol>
		<li>将装有小鼠的隧道放回饲养笼，让动物从隧道另一端自愿离开（图1C）。</li>
		<li>在饲养笼内提供零食，以支持正向强化并促进动物对操作的适应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>清洁与维护
	<ol>
		<li>从施用隧道中取出内层垫料，并用70%乙醇清洁隧道内部。</li>
		<li>若垫料保持清洁，可于后续实验中重复使用；若被污染或明显脏污，须清洗并高压灭菌后再使用。 
		注意： 每个实验组使用一块独立垫料。在不同实验之间、雄性和雌性动物之间，以及根据机构卫生指南要求时，均应更换垫料。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 腹腔给药
注意：本方法描述了一种以动物福利为导向的小鼠腹腔给药的手动保定方法。腹腔注射应仅由经过培训的人员按照机构指南以及既定的安全与卫生操作规程进行。为更便于接触注射区域，本方法结合使用注射隧道与斜面平台（楔形垫），将小鼠后部抬高。
<ol>
	<li>工作区域的准备
	<ol>
		<li>用70%乙醇清洁施用隧道和楔形块。让乙醇完全挥发，约需5分钟。</li>
		<li>将一块清洗并高压灭菌过的衬垫（将Vetbed Isobed裁剪至所需尺寸）卷起后放入隧道内（图1B）。</li>
		<li>用手指轻轻按压隧道入口处的衬垫，使剩余开口宽度约为两个相邻手指的宽度。切勿进一步压缩衬垫。</li>
		<li>将施用隧道放置在工作台面上的楔形块上（图1D），并在隧道入口前方放置另一块平整的衬垫。</li>
		<li>准备好装有27G针头并含有所需注射液的注射器，并将其放置在隧道旁边。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基于动物福利的隧道固定法 
	警告：在处理动物时，应始终根据机构的生物安全和卫生要求穿戴必要的个人防护装备（PPE）（例如，实验服、手套、帽子、口罩）。
	<ol>
		<li>使用操作管将小鼠从饲养笼中转移。将操作管直接置于施用隧道开口前方，使小鼠自愿进入施用隧道（图1C）。 
		注意：一些小鼠更倾向于先踏上施用隧道前方放置的衬垫，再自愿进入隧道。在此情况下，应先让小鼠进入隧道，再将隧道放置于楔形块上。</li>
		<li>小鼠进入后，用一只手的拇指和食指轻轻夹住尾根部，以防止小鼠过度深入隧道。小鼠通常会保持在卷起的衬垫内，不会转身。 
		注意：如果小鼠不愿进入隧道，可能是开口过小；可略微压缩隧道入口处的衬垫。如果小鼠体型过小且容易转身，可收紧卷起的衬垫或增加一层衬垫（图1B）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>腹腔注射
	<ol>
		<li>用一只手的拇指和食指夹住尾根部（图1C）。用同一只手的中指对骶部区域施加轻柔压力，并将尾巴略微向上转动。此操作可稳定动物，并清晰暴露尾腹部区域。</li>
		<li>关键步骤：持注射器与工作台面平行，插入清晰可见的尾腹部区域进行注射。</li>
		<li>注射后，轻轻释放压力并松开尾巴。 
		警告：使用后的针头/注射器应立即丢弃至防穿刺、防泄漏的锐器盒中。切勿尝试重新盖上针帽，以防针刺伤害。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>释放与正向强化
	<ol>
		<li>将含有小鼠的隧道移回饲养笼，让动物从隧道的另一端自愿离开（图1C）。</li>
		<li>在饲养笼中提供零食，以支持正向强化并促进动物对操作程序的习惯化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>清洁与维护
	<ol>
		<li>从施用隧道中取出内衬垫。用70%乙醇清洁施用隧道和楔形块。</li>
		<li>若衬垫保持清洁，可重复用于后续实验。若被污染或明显脏污，需清洗并高压灭菌后方可再次使用。 
		注意： 每个实验组应使用单独的衬垫。在不同实验之间、雄性和雌性动物之间，以及根据机构卫生指南要求时，均应更换衬垫。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 从尾静脉采血
注意：本方法描述了一种以动物福利为导向的小鼠尾静脉采血的手工保定方法。所有操作必须由经过培训的人员按照机构指南以及既定的安全与卫生规程进行。
<ol>
	<li>工作区域的准备
	<ol>
		<li>使用70%乙醇清洁操作隧道。让乙醇完全挥发，约需5分钟。</li>
		<li>将一块清洗并高压灭菌过的衬垫（将Vetbed Isobed裁剪至所需尺寸后卷起）放入隧道内（图1B）。</li>
		<li>用手指轻轻按压隧道入口处的衬垫，使剩余开口宽度约为两个相邻手指的宽度。不要进一步压缩衬垫。</li>
		<li>将操作隧道放置在工作台面上，并在隧道入口前方放置另一块平整的衬垫。</li>
		<li>确保采血针、血液收集微量管、棉签和消毒喷雾剂均已备妥，便于取用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基于动物福利的隧道固定法 
	警告：在处理动物时，必须根据机构的生物安全和卫生要求穿戴必要的个人防护装备（PPE）（例如防护服、手套、帽子、口罩）。
	<ol>
		<li>使用抓取管将小鼠从饲养笼中转移。将抓取管直接置于操作隧道开口前方，使小鼠可自愿进入操作隧道（图1C）。 
		注意：部分小鼠倾向于先踏上放置在操作隧道前方的衬垫，再自愿进入隧道。可通过轻轻握住尾根部，防止小鼠在隧道内行走过深。</li>
		<li>小鼠进入后，通常会停留在卷起的衬垫内，不会转身。 
		注意：若小鼠不愿进入隧道，可能是开口过小；可略微压缩隧道入口处的衬垫。若小鼠体型过小且容易转身，可收紧卷起的衬垫或增加一层衬垫（图1B）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采血
	<ol>
		<li>用手握住尾尖，轻轻拉直尾巴，并对预定采血部位进行消毒。将尾巴旋转约90°，使侧尾静脉位于背侧。</li>
		<li>关键步骤：使用采血针穿刺侧尾静脉。用微量管或毛细管收集血液滴。 
		警告：使用后的采血针应立即丢弃至防穿刺、防泄漏的锐器盒中。切勿尝试重新盖上针帽，以防针刺伤。</li>
		<li>采血后，用无菌棉签对穿刺部位施加轻柔压力，以控制出血。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>释放与正向强化
	<ol>
		<li>将装有小鼠的隧道移回饲养笼，让动物从隧道的另一端自愿离开（图1C）。</li>
		<li>在饲养笼中提供零食，以支持正向强化，并促进动物对操作程序的习惯化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>清洁与维护
	<ol>
		<li>从操作隧道中取出内衬垫。使用70%乙醇清洁操作隧道。</li>
		<li>若衬垫保持清洁，可于后续实验中重复使用。若被污染或明显脏污，需清洗并高压灭菌后方可再次使用。 
		注意：每个实验组应使用单独的衬垫。在不同实验之间、雄性和雌性动物之间，以及根据机构卫生指南要求时，均应更换衬垫。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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</ol>

A.S.、J.K.U. 和 L.H. 拥有德国注射隧道的实用新型专利（注册号：20 2024 100 448）。其余所有作者声明无利益冲突。

本研究开发了一种用于物质给药和采血的固定技术，旨在支持动物福利的最佳实践方法。尽管如此，一些科研领域仍对采用与长期确立的标准操作程序不同的精细化操作和固定方法持保留态度，特别是当这些新方法可能需要额外的时间和精力时。然而，降低实验动物的应激反应不仅符合动物福利的要求，而且有助于提高实验的成功率，通过减少数据变异性、最小化应激引起的生理变化，并降低操作失败率和动物淘汰率。本方案介绍了一种易于实施的方法，可在确保牢固固定和安全进行给药与采样操作的同时，显著改善动物福利。
该方案中的一个关键步骤是确保动物顺利进入应用隧道并保持稳定的定位。为实现动物自主进入，推荐两种可能的方法：一种是从转移管直接进入隧道，另一种是先将小鼠从转移管转移到预先放置好的柔软内衬上，再由其自行进入隧道。最佳方法取决于动物的行为表现，两种方式均应进行评估。优先选择小鼠进入速度最快且抗拒最少的方式。若小鼠犹豫不决不愿进入隧道，应考虑以下几个因素：（1）入口可能过窄，此时可轻微压缩内衬以扩大开口；（2）内衬的气味线索可能影响接受程度，因此内衬应尽量保留熟悉的笼具气味，同时确保实验组、笼具和性别的隔离，并及时更换污染材料以避免干扰性气味；（3）研究表明，小鼠在颜色与其毛色相近的表面上会感觉更安全14，因此将内衬颜色与动物毛色匹配可能更有利；（4）将隧道开口朝向笼壁方向可促进进入，因为小鼠仍能看到家园笼及同伴。应用隧道的一个潜在局限在于其依赖动物自主进入，这可能被认为在处理或采样前引入短暂延迟。然而，在本研究中，小鼠通常能在2–10秒内快速且一致地进入隧道，使得操作可在狭窄且可重复的时间窗口内完成。尽管该方法所需时间可能略长于传统的抓颈固定法，但应权衡略微延长的操作时间与通过减少操作相关应激而显著改善的动物福利。此外，传统固定装置的插入过程同样涉及操作时间，因为小鼠常会抗拒安置，导致实际耗时并无显著差异。在少于5%的情况下，小鼠未能自主进入隧道。虽然上述措施通常足以促进进入，必要时也可轻柔辅助动物进入隧道。即使在这些情况下，柔软的内衬仍比传统固定装置在动物福利方面具有优势。
小鼠进入隧道后，能够牢固地抓握内衬表面。从动物福利的角度来看，这种设计非常有利，因为已有研究表明，当小鼠在被操作过程中能够抓握表面时，其应激水平显著降低4。同时，操作者可以稳固地握住小鼠尾部基部，而小鼠不会试图转身。内衬必须紧密贴合动物身体。若小鼠体型过小而在隧道内发生旋转，可通过进一步收紧卷起的内衬或增加额外层来快速调整。对于涉及不同体型动物的实验（例如因年龄、性别或饮食不同），也可使用不同直径的隧道（参见打印模板8）。
注射和采血操作应始终由经过培训的人员进行。然而，该应用隧道对经验丰富的操作人员和经验较少的使用者均有效。特别是，经验不足的人员报告称操作失败次数减少，从而降低了重复抓握和延长操作时间的需要。使用者还表示，与学习传统的徒手固定技术相比，使用隧道固定小鼠时感觉更加舒适和安全。对于人员流动频繁的实验室而言，这具有显著优势，因为该方法易于掌握，且对动物和实验人员均有益处。这些观察结果与此前关于改进型操作技术（如隧道法和杯式法）可提高操作舒适度和技术人员信心的报道一致。15.
重要的是，本文所述方法即使在未经训练的小鼠中也有效，所有结果均来自未经预先适应的动物。先前的研究表明，通过对动物进行适应性训练和医学训练，使其熟悉预定操作程序，可降低小鼠的应激反应16,17因此，结合使用通道的训练方案或可进一步降低动物的应激水平，尤其是在需要频繁干预的情况下，避免动物对通道产生负面联想。此前一项研究已成功应用了此类训练程序，使我们能够在数周内利用该通道进行多次腹腔注射。8在需要反复注射的研究中，这种隧道装置可能是一项重要的优化措施。使用转移管并减少束缚的优化操作技术已被证明可在多次抓颈保定或腹腔注射后仍维持积极效果，包括增加动物与操作人员互动的意愿，并减少在标准行为学测试中表现出的类似焦虑行为。18,19. 同样，在隧道内进行的重复注射并未增加小鼠的应激相关参数8.
在实践中，食物奖励已被证明可通过正向强化促进动物的习惯化，这是动物训练中一个公认的原则。因此，建议在每次抓取操作结束后提供少量零食作为奖励。在测试给药隧道时，极少量的食物（例如单粒燕麦）已足够，且不太可能干扰动物的正常饮食。如果食物摄入量需要控制，例如在代谢研究中，也可选用与特殊饮食相容的调味零食（如生酮饮食）。重要的是，应将零食视为一种额外的优化措施，用于增强习惯化效果，而非使用给药隧道成功的先决条件。一旦小鼠熟悉该系统，即使不给予食物奖励，也会主动并反复进入给药隧道。
本方法在接触特定身体区域方面存在一定的局限性。虽然尾部可安全、方便地用于静脉注射和采血，尾腹部区域适用于腹腔注射，但对体侧部位进行皮下给药的操作空间有限。口服给药也需谨慎考虑。传统的灌胃法不适用于该系统，因为无法实现所需的颈部伸展。然而，更精细的口服给药方法可能通过隧道的开放侧实现，例如让小鼠自愿从移液器尖端摄取物质（如与炼乳混合的药物）20。在此类情况下，必须确保小鼠头部清晰可见，且其未过深地处于衬垫或隧道内部，以便确认物质已被完全摄入。
与现有的束缚管相比，本文所述的应用管在动物福利方面具有明显优势。尽管在安全给药和采样操作中，对动物进行束缚通常是必要的，但这也被公认为啮齿类动物在实验过程中所经历的最大应激源之一7,21,22 。已有研究证实，用优化的方法（如管道抓取或杯式抓取）替代传统的抓尾操作和束缚方式，可显著改善动物福利。采用这些优化方法处理的小鼠表现出更低的焦虑水平，并且更愿意与操作人员互动，而抓尾处理的小鼠则表现出较少的互动意愿23,24 。应用管由小鼠自愿进入，是管道抓取法的一致延伸。小鼠离开应用管时的面部表情评分表明，动物并未感到被束缚或被困。尽管腹腔注射时让小鼠抓住笼具网格的方式与本文描述的提起骨盆区域的抓握方法相似5，但前者基于动物试图逃脱的挣扎行为。在网格上，小鼠会用爪子抓紧并向前拉扯，试图远离操作者的手，从而导致身体被强制固定，引发痛苦。此外，此类束缚还会增加腹肌张力，进而加剧针头穿刺带来的疼痛感。相比之下，应用管代表了一种优化的束缚方法，实验结果表明其可降低与应激相关的各项参数，包括更低的面部表情评分、更少的可听见发声以及持续保持与操作人员互动的意愿811,12,13。尽管超声波发声（USVs）正日益被视为具有生态学意义的交流信号，但其作为成年小鼠应激标志物的用途仍在研究中，因为超声波发声具有高度的情境依赖性，也可能出现在正常的生理行为过程中25。
然而，最近的证据表明，超声波 vocalization（USV）记录可能是一种有前景的、非侵入性且可重复的方法，用于评估动物对固定状态的行为反应26。因此，在未来的研究中引入USV记录可提供一种额外的客观指标，以进一步表征应激和情绪反应。 综合这些发现表明，与传统的固定装置相比，应用隧道能够在常规操作和采样过程中实现更安全、更少应激的固定程序。重要的是，与透明丙烯酸固定装置不同，该隧道内部柔软的衬里使小鼠能够牢固地抓握表面，根据NC3Rs的建议，这被视为一项重要的动物福利改进措施27。在隧道内观察到明显更少的转身尝试行为，从而同时提升了动物福利和操作安全性。在传统的塑料固定装置中，动物尝试转身常伴随排尿现象，由此导致的毛发潮湿进一步降低了舒适度。这一问题在使用应用隧道后已基本消除。
该方法的潜在应用范围十分广泛。值得注意的是，改进后的固定方法不仅限于小鼠，当使用直径更大的通道时，也可应用于大鼠（补充图1）。啮齿类动物是科学研究各领域中最广泛使用的实验动物物种，在许多实验室中，对动物进行固定以实施给药或采样属于常规操作。然而，研究表明，固定应激不仅会影响动物福利，还会显著影响科学结果，包括行为反应28,29以及免疫功能等生理机制30。因此，减少与应激相关的变异性对于动物实验的科学有效性与伦理考量均至关重要。该通道装置在保持安全、实用操作的同时降低了与固定相关的应激，有望显著提高实验质量与可重复性，并同步改善动物福利。

动物实验在生物医学研究中仍发挥着核心作用，对理解疾病机制以及评估药物和化学物质的有效性与安全性具有重要意义。啮齿类动物是最常用的实验动物物种；在欧盟，2023年约有350万只小鼠和50万只大鼠被用于科学研究1。随着社会对实验过程所导致动物痛苦的关注日益提高，依据“3R原则”2,3，已出台相关法律法规以改善科研中的动物福利。由于目前尚无法完全以替代方法取代动物实验，因此优化现有的实验操作显得尤为重要，以减轻实验动物所承受的痛苦。操作过程中的抓取与固定（例如注射时的约束）是实验动物在日常护理和实验过程中最常见的干预措施之一。
传统的用于腹腔注射的固定束缚方法包括用拇指和食指紧紧抓住动物颈部的皮肤和毛发，固定其尾巴，并将动物翻转以暴露腹部进行注射。这种姿势不符合自然状态，可能导致动物呼吸困难，从而引发恐惧4。目前已描述了多种改进的束缚技术，例如所谓的“三指法”，与传统的抓颈法相比，该方法减少了对颈部区域的压力4。另一种方法则在很大程度上避免了完全的固定：在此方法中，动物可以抓住金属丝网，同时其尾巴和后肢被固定，以便接触下腹部进行注射5。然而，这两种操作均存在局限性。使用三指法时，动物仍需被提起并置于非自然体位，可能诱发应激反应。而另一种技术则无法充分防止处于应激或防御状态的动物咬伤操作者，且可能限制注射操作的时间。除了潜在的咬伤风险外，还存在因束缚不当或意外针刺伤而带来的额外风险。进行尾静脉注射或采血时所需的固定装置无需用手直接抓握动物即可实现 immobilization，从而解放双手用于操作。这类固定装置通常是由透明丙烯酸材料制成的管状结构，一端封闭并设有供尾巴伸出的槽口或孔洞，另一端开放以插入小鼠，并可通过可调节的塞子加以固定。该操作要求通过尾巴抓取动物，并使其尾部朝前、头朝后拉入固定管中，以便将尾巴穿过通路槽口。由于固定管的内径通常较窄，以防止小鼠在操作过程中转身造成伤害，因此这一过程具有较大应激性6,7。
本方案介绍了一种新开发的用于小鼠注射和采血的应用隧道装置，该装置可在减少刺激的同时仍实现安全固定。该隧道由一个刚性外框和可拆卸的绒布内衬组成，形成一个柔软、黑暗的空间，类似于洞穴。与传统限制器相比，该隧道特意设计为更大的尺寸，以容纳按尺寸裁剪的 Vetbed Isobed 插入垫，提供柔软舒适的内层，增强动物的安全感，同时保持足够的固定效果（图 1A–B）。隧道两端均开放，小鼠可从前方直接走入，并从后方离开。一旦进入隧道，动物无法转身，而尾部仍可接触，便于进行静脉注射或采血（图 1C）。对于腹腔注射，可将隧道倾斜放置（图 1D），同时握住动物尾根部并对骶部施加轻柔压力，使小鼠后端向上弯曲（图 1C）。该方法对小鼠和实验操作者均更为温和，无需手动固定。
先前的一项研究表明，在腹腔注射实验中使用隧道可持久降低小鼠的应激水平，改善其福利状况，即使在需要频繁进行腹腔注射的实验模型中亦是如此8。在本研究中，该应用隧道还成功用于雄性和雌性小鼠的尾静脉注射及尾静脉采血。

<table><tbody><tr><td>无菌采血针</td><td>Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH, Hamburg, Germany</td><td>1110106</td><td></td></tr><tr><td>带可选楔形块的应用隧道</td><td>实验室3D打印隧道</td><td></td><td>打印模板可从 https://osf.io/vsjnb 获取。</td></tr><tr><td>血液收集管：Microvette 100 EDTA K3E，100 &amp;micro;L&amp;nbsp;</td><td>SARSTEDT AG &amp; Co. KG, N&amp;uuml;mbrecht, Germany</td><td>20.1278.100</td><td></td></tr><tr><td>透明操作管</td><td>Datesand Group, Stockport, UK</td><td>GZCHTUBE-100</td><td>尺寸：50 × 3 × 100 mm</td></tr><tr><td>乙醇，&amp;ge;70%</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>T913.1</td><td></td></tr><tr><td>Inject-F 一次性精密剂量注射器，1 mL&amp;nbsp;</td><td>B.Braun Deutschland GmbH &amp; Co. KG, Melsungen, Germany</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>燕麦</td><td>Schapfen M&amp;uuml;hle GmbH Co.KG, Ulm, Germany</td><td>W100197</td><td>已高压灭菌</td></tr><tr><td>Sanitas SIL 06 红外灯</td><td>Beurer Europe GmbH, Ulm, Germany</td><td>61424</td><td></td></tr><tr><td>柔软内衬：Original Vetbed Isobed SL</td><td>Vetbed Deutschland, Mudersbach, Germany</td><td>1999981</td><td>裁剪至所需尺寸</td></tr><tr><td>Softasept ISO 70% 消毒喷雾剂</td><td>B.Braun Deutschland GmbH &amp; Co. KG, Melsungen, Germany</td><td>19905</td><td></td></tr><tr><td>一次性无菌皮下注射针头 Sterican 27 G × &amp;frac34;</td><td>B.Braun Deutschland GmbH &amp; Co. KG, Melsungen, Germany</td><td>4657705B</td><td>尺寸：0.40 mm × 20 mm</td></tr><tr><td>棉签：FIWA app 医用涂抹器</td><td>Fink &amp; Walter GmbH, Merchweiler, Germany</td><td>329012</td><td></td></tr></tbody></table>

以福利为导向的小鼠给药与采血人工固定技术

Welfare-Oriented Manual Restraint Technique for Substance Administration and Blood Sampling in Mice

动物实验在生物医学研究中仍然至关重要，对理解疾病机制以及评估药物和化学物质的疗效与安全性具有重要意义，其中啮齿类动物是最常用的实验动物之一。在实验室操作中，常见的干预措施包括在注射和采血等操作过程中对动物进行抓取和固定，这些操作通常在未使用镇静剂或麻醉剂的情况下对清醒小鼠进行。适当的固定对于确保动物和操作人员的安全十分必要。然而，传统的固定方法，如徒手固定或固定管，已知会引发小鼠的急性应激反应，从而对动物福利产生负面影响，并可能干扰实验结果。为了在3R原则（替代、减少、优化）的框架内推动实验方法的优化并改善动物福利，本方案介绍了一种新开发的应用隧道装置，用于小鼠的注射和采血操作。该隧道提供了一种比传统技术更温和但依然可靠的固定方式。这种以福利为导向的固定方法可轻松应用于腹腔注射、静脉注射和采血等常规操作，同时最大限度地减少应激反应，改善实验小鼠的操作条件。

为评估新固定技术对小鼠福利的影响，按照所述方案进行了尾静脉采血和静脉注射。雄性和雌性野生型 C57BL/6 小鼠分别在应用隧道或传统固定器中接受操作，并对其疼痛和应激迹象进行评估。采用小鼠面部表情评分（MGS）评估尾静脉采血后小鼠的应激水平。MGS 是一种广泛应用的评分系统，通过分析面部肌肉的反应来评估疼痛或应激性操作引起的反应9,10。为确定评分，在小鼠脱离固定器或隧道后立即拍照（代表性图像见图2）。两名具有小鼠行为评估经验的观察者对三个面部表情参数（见图2C中的示意图）进行评估：眼眶紧缩（眼睑闭合、眼眶区域变窄；眼睛周围可能出现皱褶）、鼻部隆起（鼻梁处隆起，鼻侧出现垂直皱褶）以及耳部位置（耳朵向外和/或向后旋转远离面部，可能折叠成“尖形”；耳间距离增大）。由于小鼠毛色较深，胡须位置和颊部隆起难以可靠评估，因此未予评分。每个参数采用0至2的三分制评分（0 = 无，1 = 中度存在，2 = 明显存在），三个面部参数的评分取平均值，得到每只动物的平均 MGS 评分。为确保可靠性，两名观察者分别独立且盲法对每只动物进行评分，随后将两个 MGS 评分取平均，生成每只动物的最终 MGS 评分。无论雌性还是雄性小鼠，在应用隧道中进行采血时，其 MGS 评分均显著低于使用传统固定器时（图2A–B）。
另设一组小鼠，接受100 µL 0.9%氯化钠（NaCl）静脉注射，并记录其在固定装置中发出可听见叫声以及试图转身的行为。小鼠通过可听见的尖叫声表达严重不适，尤其是在经历疼痛、恐惧或表现出防御行为时11,12,13。此外，小鼠在受到物理限制时通常会产生恐慌反应，表现为试图逃离受限空间的逃避行为。因此，在固定装置中尝试转身180度被视为恐惧的表现。在雌性和雄性小鼠中，与使用应用隧道相比，在固定装置内进行静脉注射时，可观察到更高频率的可听见叫声及转身尝试（图3）。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72535/72535fig1v1.jpg" /> 
图1：新型给药隧道。（A）代表性图像，展示传统固定器与新型给药隧道在尺寸上的差异。（B）隧道内衬由按尺寸裁剪并卷起的Vetbed材料制成，提供柔软、支撑性强且黑暗的环境。若小鼠体型过小且容易转身，可收紧卷起的内衬以减少内部空间。（C）在给药隧道内进行的不同操作步骤，包括进入与退出、安全舒适的固定，以及对腹部和尾部的接触。（D）一个附加的楔形垫块，用于在隧道内进行腹腔注射。该楔形垫块可增大隧道相对于操作者的手部角度，便于更方便地接触腹部区域。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72535/72535fig1largev1.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72535/72535fig2v1.jpg" /> 
图2小鼠尾静脉采血后的面部表情评分 雄性或雌性小鼠在应用隧道内或传统固定器内接受采血。动物离开固定器或隧道后立即拍摄面部照片，用于评估小鼠面部表情评分。照片由两名经验丰富的实验人员独立评分，评分者对小鼠的分组情况设盲，并评估眼眶收缩、鼻部隆起和耳部位置。根据两名评分者的评分结果，计算每只动物的平均得分。A) 雌性小鼠（tunnel n = 5；restrainer n = 8）。B雄性小鼠（隧道法 n = 11；固定器法 n = 11）。该图改编自 Schlutt 等，2026。 PLOS ONE原始数据以条形图形式发表，采用 CC BY 4.0 许可协议，此处已对其进行修改并重新绘制为箱线图。C) 使用 ChatGPT Image 2（OpenAI；可从 <a href="https://chatgpt.com/" target="_blank">https://chatgpt.com/</a>）；最终图像经作者审阅并确认科学准确。数据以箱线图（最小值至最大值）表示；线段表示均值。Mann-Whitney 检验， p-值 &#60; 0.05 被视为具有显著性。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72535/72535fig2largev1.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72535/72535fig3v1.jpg" /> 
图3静脉注射后出现可听见的发声及试图翻身的行为。 雄性或雌性小鼠接受静脉注射 100 &#181;L 0.9% NaCl 注射至加样通道内或常规固定装置中。记录操作过程中动物在固定装置内发出可听见的发声及试图转身的情况（是/否）。所有组别 n = 10。数据以堆叠式条形图表示。Fisher 精确检验， p-值 &#60; 0.05 被视为具有显著性。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72535/72535fig3largev1.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
补充图1：使用较大型号的应用隧道对大鼠进行腹腔注射。 采用直径为15 cm的应用隧道对大鼠进行腹腔注射。操作步骤与小鼠所述方案相同。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72535/Supplementary Figure 1.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案描述了一种用于在注射或采血过程中固定小鼠的新型手动保定方法，从而减少实验过程中的应激反应并改善动物福利。

动物实验在生物医学研究中仍然至关重要，对理解疾病机制以及评估治疗手段的有效性和安全性做出了重要贡献。

我们的研究重点是有效的啮齿类动物固定方法，旨在提高动物和操作人员在生物医学操作过程中的安全性，同时尽量减少动物应激反应。传统的固定小鼠方法可能引发应激反应，从而影响实验结果。本方案在保持操作有效性的前提下，提供了更安全、应激更小的固定方法。首先，用70%乙醇清洗施加通道，并静置约五分钟，待其完全挥发。将一块已清洗并经高压灭菌的衬垫卷成卷状，放入施加通道内。用手指轻轻挤压通道入口处的衬垫，使剩余开口宽度约为两个相邻手指的宽度。然后，将施加通道放置在工作台面上，并在通道入口前方放置另一片平整的衬垫。准备一支装有27号针头并已装入所需注射溶液的注射器，将其置于施加通道旁。确保棉签和消毒喷雾剂 readily available。转移小鼠时，将操作管置于转运隧道前方，使小鼠自愿进入隧道内。进入后，让小鼠保持位于卷起的衬垫内部，不要转身。用一只手握住小鼠尾尖将其轻轻拉直，并对预定的注射部位进行消毒。将尾巴旋转约90度，使尾侧静脉位于背侧。从尾部远端开始注射，以15至20度的角度进针，针头方向几乎与尾巴平行，以便在需要时保留近端位置用于再次尝试。进针深度仅需略微超过针尖斜面即可。以缓慢、稳定的速度注射所需体积，注射速率不超过每千克体重5毫升，持续13秒。然后拔出针头，并用无菌棉签对注射部位施加轻柔压力，以防止出血。将装有小鼠的应用隧道放回鼠笼，让小鼠从应用隧道的另一端自主离开。在鼠笼内提供零食，以加强正向强化并促进小鼠对操作程序的适应。取出涂抹管腔的内衬并用 70% 乙醇清洁管腔。如果内衬干净，可重复使用；否则在重复使用前需清洗并高压灭菌。在制备好给药通道后，将其置于工作台面上楔形物的上方，并在通道入口前方放置一条额外的平直衬垫。让小鼠如先前演示的那样进入给药通道。用一只手的拇指和食指夹住小鼠尾部的基部，用同一只手的中指在骶部区域施加轻柔压力，并将尾部略微向上抬起。固定小鼠体位，以充分暴露尾腹部区域。持注射器与工作台面平行，将针头插入清晰可见的尾腹部区域进行注射。注射完成后，轻轻释放施加的压力和尾部，让小鼠退出通道，并如前所述清洁给药通道。在制备通道并让小鼠自愿进入采样通道后，用手捏住小鼠尾尖轻轻拉直尾巴，并对预定采样部位进行消毒。将尾巴旋转约90度，使侧尾静脉位于背侧。使用采血针穿刺侧尾静脉，并用微量管或毛细管收集血液滴。之后，用无菌棉签对穿刺部位施加轻柔压力以止血，随后给予正向强化刺激并清洁通道，操作步骤如前所示。与使用传统固定器相比，雌性和雄性小鼠在应用隧道内采血时，小鼠面部表情评分均显著降低。在雌性和雄性小鼠中，静脉注射时在应用隧道内操作相较于传统固定器，可观察到更少的可听见发声和试图转身行为。我们的新型应用隧道可在常规注射和采血过程中实现对小鼠的低应激、安全固定，同时改善操作便利性和动物福利。需要注意的是，该方法仅适用于清醒动物，且仅可接触尾部和下腹部。未来的研究可将此方法拓展应用于大鼠，并探索其在不同生物医学操作、动物模型和科研应用中的有效性。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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