Name: 在体外和体内生物发光记者人类胚胎干细胞的基因显像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-02T17:59:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: 学习利用生物发光报告基因和CCD成像技术，在小鼠体内无创追踪人胚胎干细胞的增殖与迁移行为。该方法为干细胞治疗研究提供可靠的活体监测手段。

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感谢 Tim Doyle 博士和斯坦福体内成像中心在生物发光成像方面提供的帮助。同时感谢 Ngan Huang 博士分享其干细胞与基质溶液共注射的技术。最后，感谢 Steve Felt 博士在实验动物兽医护理方面的协助。

<ol>
<li>双融合报告基因的构建<ol>
<li>为了对人胚胎干细胞进行生物发光成像，首先需要获得能够稳定表达报告基因（例如由Ubiquitin或EF1a等组成型启动子驱动的萤火虫荧光素酶）的细胞。</li>
<li>本实验方案的重点在于报告基因的应用，因此此处不提供详细操作步骤。然而，我们实验室的一般策略是使用一种双融合结构载体，该载体在pCDNA 3.1+中包含由间隔序列分隔的萤火虫荧光素酶（fluc）和增强型绿色荧光蛋白（egfp）。</li>
<li>简而言之，我们的双融合基因最初位于pCDNA 3.1(+)中巨细胞病毒（CMV）启动子的下游，因此通过NdeI和NotI酶切释放出3.3 kbp片段，并经平末端连接将其插入自失活（SIN）慢病毒载体的多克隆位点，由Ubiquitin启动子驱动表达。 </li>
</ol></li>
<li>慢病毒转导<ol>
<li>人胚胎干细胞（hESCs）可在传代后3-5天以感染复数（MOI）为10的条件进行转导（病毒滴度约为10⁷，与10⁶个细胞共孵育）。</li>
<li>解冻后的病毒储存液可直接加入新鲜的hESC培养基中。</li>
<li>12小时和24小时后更换培养基。</li>
<li>48小时后，可通过荧光显微镜定性评估转导效率，随后使用流式细胞术（FACS）分离被感染的细胞。 </li>
</ol></li>
<li>hESC的培养及成像系统准备<ol>
<li>将表达荧光素酶的hESCs在无饲养层条件下培养。我们通常遵循WiCell标准操作流程，使用经生长因子减少型Matrigel包被的6孔板，并采用条件培养基或商业化的无饲养层培养基。</li>
<li>为检测表达荧光素酶的细胞，需预先配制报告探针D-荧光素。具体操作为：将荧光素分装成每份1–1.5 mL，终浓度为45 mg/mL。不使用时应保存于-20°C，并避免光照，储存或使用时可用纸巾包裹避光。</li>
<li>为可视化表达荧光素酶的细胞，我们使用IVIS 50和IVIS 200成像系统（Xenogen Corporation, Alameda, CA）。后者系统配备集成的异氟烷麻醉装置和诱导室，可用于小型动物的暂时性麻醉。 </li>
</ol></li>
<li>hESCs的体外生物发光成像<ol>
<li>进行体外生物发光成像时，必须保持无菌条件，因此成像系统应处于无菌状态，最好设置在细胞培养室内。</li>
<li>成像前，移除细胞培养基，并加入适量PBS覆盖细胞。例如，在含有hESC培养物的6孔板中，每孔加入1 mL PBS。</li>
<li>D-荧光素与PBS的体积比应为1:100，因此向6孔板的每孔加入10 µL解冻后的D-荧光素溶液。</li>
<li>等待1分钟后，以1秒曝光时间采集图像。若信号较弱，可增加曝光时间并重新尝试。</li>
<li>生物发光信号强度反映细胞数量，因此可进行定量分析，将信号强度与不同细胞数量进行相关性比较。 </li>
</ol></li>
<li>小鼠准备及细胞注射用于活体成像<ol>
<li>报告基因成像是一种高通量、低成本且灵敏的方法，可用于移植后数天、数周甚至数月内对细胞进行追踪。这一点尤为重要，因为移植的干细胞常会形成畸胎瘤、被宿主免疫系统排斥，或直接死亡。</li>
<li>体内成像畸胎瘤形成的最简单方法是将表达萤火虫荧光素酶报告基因的hESCs注射至SCID小鼠背部，然后使用IVIS系统采集生物发光图像。</li>
<li>准备移植细胞时，使用dispase或胶原酶使细胞松散，反复洗涤后重悬于生长因子减少型Matrigel与DMEM按1:1比例混合的溶液中。通常我们先将细胞与预冷的DMEM混合，再加入Matrigel。每个皮下注射位点注射200,000个细胞，悬浮于50–100 µL Matrigel/DMEM混合液中。可根据实验需求调整细胞数量。注射前请确保所有试剂和器械保持在冰上。</li>
<li>细胞准备好后，将小鼠放入异氟烷诱导室中进行麻醉。1–5分钟后，小鼠进入睡眠状态，可将其转移至手术台并持续给予异氟烷维持麻醉。</li>
<li>由于毛发具有天然自发荧光，可能干扰生物发光图像，因此需要去除小鼠背部的毛发。最简便的方法是使用电动剃毛器，也可使用脱毛膏。脱毛后用酒精擦拭皮肤以消毒。</li>
<li>接下来，用注射器吸取细胞悬液。使用23至27号针头效果最佳，因其不易被细胞堵塞。若针头过粗（&lt;23号），针道可能留下较大孔洞，导致细胞回漏。</li>
<li>将细胞注射至小鼠背部皮下。由于皮肤较为松弛，可用拇指和食指捏起并拉伸待注射区域。注射时仅需刺入皮下，注意不要刺入过深。同时，在推动针栓时尽量保持针头不滑出注射部位，以防形成皮肤破口，导致再次注射时细胞外漏。</li>
<li>注射完成后，等待数小时，让小鼠苏醒并自由活动，之后再重新麻醉进行生物发光成像，以避免异氟烷毒性。 </li>
</ol></li>
<li>移植细胞的活体生物发光成像<ol>
<li>进行整体动物生物发光成像时，需按375 mg/kg体重剂量向腹腔注射D-荧光素。注射前应称量小鼠体重以计算给药量。</li>
<li>在腹中线偏侧位置进行腹腔注射，注意不要刺入过深以免损伤内脏器官。若小鼠开始苏醒，将其放回麻醉诱导室等待1–2分钟。小鼠体内生物发光信号通常在注射后15–40分钟达到峰值。</li>
<li>请记得在成像箱内放置哑光黑纸，以吸收非hESC发出的杂散光。将小鼠（背部朝上）置于成像室内的黑纸上，并通过异氟烷维持麻醉。初始曝光时间设为10秒。若信号饱和，可减少曝光时间；若信号过弱，则增加曝光时间。</li>
<li>当确定适合该小鼠的最佳曝光时间后，开始每隔一分钟采集图像，直至信号达到最大值。建议使用成像软件选择覆盖注射部位的“感兴趣区域（ROI）”，通过监测各ROI的信号强度变化，可准确判断信号何时开始下降，从而确认已达到最大信号强度。最终数据应采用最大信号值。</li>
<li>当获得满意的图像后，停止异氟烷供应，将小鼠放回笼中使其自然苏醒。通常小鼠在15分钟内即可恢复清醒。</li>
<li>只要hESCs在动物体内存活，生物发光报告基因成像可每日、每周或每月重复进行。随着hESCs开始增殖，发育中的畸胎瘤所产生的信号将随时间呈指数增长，通常在数周内显现。</li>
<li>在完成所需的生物发光成像时间序列后，可处死动物并取组织切片进行组织学分析。</li>
</ol></li>
</ol>

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<li>Liew, C. -G., Draper, J. S., Walsh, J., Moore, H., Andrews, P. W. Transient and Stable Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cell. , Forthcoming.</li>
</ol>

与其他成像方式（如PET和MRI）相比，生物发光成像的空间分辨率较低，组织穿透能力有限，这是由于其发射的光子能量相对较弱（2-3 eV）；因此，该技术迄今尚无法应用于大型动物。然而，生物发光具有成本低、通量高和非侵入性的优势，使其在小型动物体内干细胞示踪中极具应用价值。非生物发光类报告基因（如PET和荧光报告基因）可与荧光素酶基因联合使用，构建包含不同功能结构域的融合报告基因，每个结构域分别携带一种报告基因。例如，我们课题组采用一种包含荧光素酶基因（fluc）、单体红色荧光蛋白基因（mrfp）以及单纯疱疹病毒截短型胸苷激酶基因（ttk，一种PET报告基因）的融合表达载体，用于在小型动物中对干细胞行为进行多模态示踪。随着时间推移，稳定整合的报告基因可能受到细胞内源性染色质机制的影响而发生基因沉默。报告基因对基因沉默的敏感性与其表达所依赖的启动子选择密切相关。例如，巨细胞病毒启动子（pCMV）在人胚胎干细胞（hESCs）中会迅速被沉默。我们实验室在多种hESC细胞系中使用人泛素-C启动子（pUbiC）驱动双融合报告基因的表达，取得了良好效果，并观察到信号随时间推移几乎无明显衰减。
总...

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium (DMEM)</td><td></td><td>Hyclone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel&amp;#8482; 基底膜基质</td><td>生长因子减少型（可选：无酚红）</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>人胚胎干细胞维持培养基 mTeSR1</td><td></td><td>Stem Cell Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-荧光素钾盐（来自萤火虫）</td><td></td><td>Biosynth International, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IV型胶原酶溶液</td><td></td><td></td><td></td><td>将30 mg IV型胶原酶溶解于30 mL DMEM-F12培养基中。过滤除菌后于4摄氏度保存。</td></tr><tr><td>烘烤灭菌的巴斯德吸管</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6孔组织培养处理板</td><td></td><td>Techno Plastic Products</td><td>92006</td><td></td></tr></tbody></table>

体外与体内人胚胎干细胞的生物发光报告基因成像

In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells

人类胚胎干细胞（hESCs）的发现极大地拓展了再生医学领域医学科学家可用的研究工具。然而，迄今为止，将hESCs及其分化细胞直接注射到活体生物体内仍受到显著的细胞死亡、畸胎瘤形成以及宿主免疫排斥等问题的限制。要理解hESC移植后的体内行为，需要采用新型成像技术，以长期监测hESC的定位、增殖和存活情况。分子成像为研究人员提供了一种高通量、低成本且灵敏的方法，可用于在数天、数周甚至数月内追踪体内细胞的增殖过程。这一进展显著加深了人们对活体受试者中hESC植入、增殖及畸胎瘤形成的时空动力学的理解。

分子成像领域的一项重大进展是将无创性报告基因检测技术从分子与细胞生物学拓展至活体多模态成像平台。这些报告基因受人工设计的启动子和增强子调控，利用宿主细胞的转录机制，通过多种载体和非载体方法被导入细胞。一旦进入细胞，报告基因可根据所使用的启动子类型，组成型表达或仅在特定生物学或细胞条件下转录。随后，报告基因被转录并翻译成具有生物活性的蛋白质，利用信号生成探针（如D-荧光素）和高灵敏度、无创的检测仪器（例如CCD相机）即可实现检测。

为避免体内追踪干细胞时需要激发光（如荧光成像所需），生物发光报告基因成像系统仅需外源性给予探针即可诱导发光。源自萤火虫 Photinus pyralis 的萤光素酶编码一种酶，可催化 D-萤光素生成具有光学活性的代谢产物——氧萤光素。随后可通过外部CCD相机监测光学信号。稳定转导并携带报告基因构建体于染色体DNA中的细胞，可将该报告基因DNA传递给子代细胞，从而实现对人胚胎干细胞（hESC）在体内的长期存活与增殖情况进行监测。此外，由于信号生成依赖于报告基因产物的表达，只有存活的亲代和子代细胞才会产生生物发光信号；而凋亡或死亡的细胞则不会产生信号。

在本视频中，将介绍利用生物发光成像技术追踪干细胞增殖及畸胎瘤形成所需的特定材料与方法。

随着干细胞治疗研究的日益深入，分子成像技术成为监测干细胞移植后行为的理想手段。荧光素酶报告基因技术已实现对活体内细胞存活、定位及增殖情况的无创、重复评估。本视频将演示如何在活体小鼠中追踪人胚胎干细胞（hESC）的增殖过程。

人类胚胎干细胞（hESCs）的发现极大地拓展了再生医学领域科研人员可用的研究工具……

在体内，畸胎瘤形成是确定细胞多能性或形成所有三个胚层能力的金标准。畸胎瘤也是干细胞移植面临的主要障碍，目前对其在生长动力学方面的形成过程知之甚少。一旦未分化细胞被植入宿主环境，利用生物发光报告系统、基因转导以及超灵敏电荷耦合器件（CCD）成像技术，即可对细胞在体内的位置、迁移、增殖和分化进行无创性重复评估。在本视频中，我们将演示一种详细的方法，用于有效追踪移植的人类胚胎干细胞在活体小鼠体内的增殖情况。大家好，我是来自斯坦福大学医学与放射学系Joseph Wu实验室的Kit Wilson。今天我们将向您展示人类胚胎干细胞的成像方法，包括体外成像以及移植到活体小鼠体内后的成像操作流程。这些步骤包括人胚胎干细胞的体外生物发光成像、小鼠准备及干细胞注射以进行体内成像，以及移植细胞的体内生物发光成像。接下来，我们首先回顾这些操作中的关键组成部分。为了开展人胚胎干细胞的生物发光成像，首先需要获得稳定表达EL荧光素酶报告基因（例如由泛素或eef1α等组成型启动子驱动的萤火虫荧光素酶）的细胞，并在无饲养层条件下培养EL荧光素酶阳性的人胚胎干细胞。我们通常遵循标准的Y细胞操作流程，使用经Matrigel包被的六孔板，并采用条件培养基或商品化的无饲养层培养基。为了检测荧光素酶阳性细胞，您需要提前准备好报告探针d-Lucifer。将Lucifer分装成每份1至1.5毫升，终浓度为45毫克/毫升。不使用时，将分装样品保存在零下20摄氏度，并在非储存期间用纸巾包裹以避免光照。为了观察荧光素酶阳性细胞，我们将使用两种不同的成像系统：对于体外实验，将使用无菌成像系统Xeno IVUS 50；对于体内实验，则前往斯坦福体内成像中心使用Xeno IVUS 200。该系统包含一个集成的异氟烷装置和诱导室，用于小型动物的暂时麻醉。好的，我已准备就绪。接下来，我们进入体外生物发光成像。进行体外生物发光成像时，保持无菌条件至关重要。因此，成像系统应处于无菌状态，最好位于细胞培养室中。成像前，移除细胞培养基，并加入足量的磷酸盐缓冲液（PBS）以覆盖细胞即可。例如，在含有您培养的人类胚胎干细胞的六孔板的每个孔中加入一毫升 PBS。冻干粉与 PBS 的比例应为 1:100。因此，在六孔板的每个孔中加入 10 微升的冻干粉。在将derin加入培养物之前，请务必进行过滤。等待一分钟后，将培养板放入成像舱内，使用10秒的曝光时间拍摄图像，并根据需要调整曝光时间。如果信号过强而饱和或过弱，可重新调整曝光参数。由于生物发光信号反映细胞数量，因此可进行定量分析，将信号强度与不同细胞数量进行关联。这些图像来自一次典型的定量分析实验。左上角是某些人类胚胎干细胞集落的明场图像。我们知道这些细胞携带我们的报告基因，因为它们在转染后会发出绿色荧光。蓝色染色的分选为dappy染色。下方面板显示了细胞数量逐渐增加的培养孔。细胞数量

in-vitro-vivo-bioluminescence-reporter-gene-imaging-human-embryonic

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

在体外和体内生物发光记者人类胚胎干细胞的基因显像

本文描述了在转移性乳腺癌细胞生长和转移过程中，对其表达的萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的生物发光反应进行构建、可视化及定量的方法。 体内.

体内 双底物生物发光成像

本文介绍了一种优化的多模态成像流程，用于在啮齿类动物脑内对细胞移植物进行多模态成像，包括：（i）活体生物发光成像与磁共振成像，以及（ii）死后组织学分析。在单个动物上联合使用这些成像方式，可实现对细胞移植物的高分辨率、高灵敏度和高特异性的评估。...

小鼠中枢神经系统干细胞移植的多模态成像

我们描述了一种荧光报告基因检测方法，可用于快速鉴定和表征调控小鼠胚胎干细胞维持与自我更新的基因。...

Oct4GiP 报告基因检测法用于研究调控小鼠胚胎干细胞维持与自我更新的基因

昼夜节律钟在单个细胞内发挥作用，即具有细胞自主性。本文描述了利用非侵入性的、基于荧光素酶的实时生物发光技术构建细胞自主性节律钟模型的方法。报告基因细胞为研究昼夜节律生物学提供了易于操作且功能明确的模型系统。...

利用荧光素酶生物发光报告系统监测细胞自主性基因表达的昼夜节律

本文介绍了将携带lux标记的细菌给予小鼠，并随后使用IVIS生物发光成像进行活体分析的方法。...

活体生物发光细菌成像 In Vivo

来源：Weber, R. Z., 等，小鼠脑内人神经前体细胞的颅内移植与活体生物发光示踪。J. Vis. Exp.

活体小鼠脑内人神经前体细胞的生物发光成像

本方案描述了源自人胚胎干细胞（hESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）的自然杀伤细胞（NK细胞）的体外分化、扩增及体内成像技术。...

发育、扩增与 体内 人胚胎干细胞（hESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）来源的自然杀伤细胞的监测

在不同遗传背景下对单个野生型视网膜前体细胞进行活体追踪，可评估细胞非自主性信号在神经发生过程中的作用。本文结合基因敲低、通过胚胎移植构建嵌合体以及 体内...

体内成像嵌合体斑马鱼胚胎中单个视网膜前体细胞的转基因表达以研究细胞非自主性影响

神经干细胞/前体细胞表现出Notch信号通路组分的多种表达动态，从而导致细胞事件的不同结果。此类动态表达可通过高灵敏度的生物发光成像系统进行实时监测，而非静态分析，从而实现对基因表达快速变化的可视化观察。...

实时生物发光成像监测小鼠神经发生过程中Notch信号动态变化

我们描述了将经携带双报告基因载体（表达荧光素酶-绿色荧光蛋白（GFP））转导的人类神经前体细胞移植至小鼠脑实质内的方法。移植后，利用活体成像系统反复检测荧光素酶信号。 体内 利用荧光显微镜在脑组织切片中鉴定表达生物发光和GFP的移植细胞。...

颅内移植与 体内 小鼠大脑中人神经前体细胞的生物发光示踪

昼夜节律存在于大多数生物体中，可调控生物过程的时间组织。3D类器官最近已成为一种生理相关性较强的模型系统 体外 模型。本方案描述了使用生物发光报告基因在类器官中观察昼夜节律的方法，从而实现 体外...

利用生物发光报告系统监测类器官中的昼夜节律振荡

学习利用生物发光报告基因和CCD成像技术，在小鼠体内无创追踪人胚胎干细胞的增殖与迁移行为。该方法为干细胞治疗研究提供可靠的活体监测手段。

体外与体内人胚胎干细胞的生物发光报告基因成像

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