在体外和体内生物发光记者人类胚胎干细胞的基因显像
May 2nd, 2008
分子成像技术在干细胞疗法的兴趣与日俱增，是理想的监测干细胞移植后的行为。荧光素酶基因已启用非侵入性，重复评估细胞的存活，位置，并在体内扩散。本视频将演示如何跟踪生活在一个小鼠胚胎干细胞增殖。
在体内，畸胎瘤的形成是确定细胞多能性或形成所有三个胚层的能力的金标准。畸胎瘤也是干细胞移植的一大障碍，目前对其在生长动力学中的形成知之甚少。一旦未分化的细胞被植入宿主环境，生物发光报告基因、基因转导和超灵敏电荷耦合装置或 CCD 摄影的发展就能够对体内细胞位置的迁移、增殖和分化进行无创重复评估。
在本视频中，我们将演示有效追踪活小鼠中移植的人胚胎干细胞增殖的详细方案。大家好，我是来自斯坦福大学医学和放射学系 Joseph Wu 实验室的 Kit Wilson。今天，我们将向您展示在体外和移植到活小鼠体内后对人胚胎干细胞进行成像的程序。
这些程序包括以下步骤：人胚胎干细胞的体外生物发光成像、小鼠制备和干细胞注射，用于移植细胞的体内成像和体内生物发光成像。因此，让我们从回顾这些过程的一些关键组成部分开始。为了对人胚胎干细胞进行生物发光成像，您首先需要获得稳定表达 EL 荧光素酶报告基因（如萤火虫荧光素酶）的细胞，由组成型启动子（如泛素或 eef one α 培养物）驱动，在无饲养层条件下，您的 EL 荧光素酶阳性人胚胎干细胞。
我们通常遵循标准 Y 细胞方案，并使用条件培养基或商业无饲养层培养基包被基质胶的 6 孔板。为了检测荧光素酶阳性细胞，您需要让报告探针 d Lucifer 准备好执行此作。将 Lucifer 分装在 1 至 1.5 mL 制剂中，终浓度为 45 毫克/毫升。
不使用时将等分试样保持在零下 20 摄氏度，不存放时用纸巾盖住以避免暴露在光线下。为了可视化荧光素酶阳性细胞，我们将使用两种不同的成像系统。对于体外程序，我们将使用无菌成像系统 Xeno IVUS 50，对于体内手术，我们将前往斯坦福中心进行体内成像，以使用 Xeno IVUS 200。
该系统包括一个集成的 isof lorrine 装置和用于小动物临时麻醉的诱导室。好吧，我有我自己。让我们继续进行体外生物发光成像。
对于体外生物发光成像，保持无菌条件很重要。因此，成像系统应该是无菌的，最好在细胞培养室中。成像前，去除细胞培养基并添加足够的 PBS 以覆盖细胞。
例如，向含有人胚胎干细胞培养物的六孔板的每个孔中加入 1 毫升 PBS。derin 与 PBS 的比例应为 1 比 100。因此，向 6 孔板的每个孔中加入 10 微升解冻的 derin。
请记住在添加到培养物之前过滤 derin。等待一分钟后，将板放入腔室中，然后使用 10 秒的曝光时间拍摄图像，调整曝光时间。如果信号饱和或太弱，生物发光信号会反映细胞数量，因此可以进行定量分析，将信号与不同的细胞数量相关联。
这些是从典型的定量分析中获取的图像。左上角是一些人类胚胎干细胞集落的亮场。我们知道这些细胞携带我们的报告基因，因为它们在事后会发出绿色荧光。
对蓝色进行排序是 dappy 染色。底部面板显示了细胞数量增加的培养孔。细胞数量与生物发光信号相关，如图所示。
这种相关性为我们提供了一种用于跟踪体内细胞增殖的半定量测定法。好的，这就是体外程序。现在让我们继续进行体内生物发光成像。
为了对体内畸胎瘤的形成进行成像，我们将表达萤火虫荧光素酶报告基因的人类胚胎干细胞注射到滑行小鼠的背部，并使用 IVU 系统拍摄生物发光图像。当您准备好移植细胞时，使用椎间盘间隙或胶原酶将细胞松散，洗涤数次，并将它们悬浮在生长因子、还原基质胶和 dmm 的一对一混合物中。通常，我们首先将细胞与冷冻的 DMM 混合，然后加入基质胶。
对于每个皮下部位，我们注射 200， 000 个细胞悬浮在 50 至 100 微升体积的基质胶 DMM 混合物中。细胞数量可以根据您的应用进行调整。请记住在注射前将所有物品放在冰上。
一旦细胞准备好，我们通过将小鼠放入诱导盒中来麻醉小鼠。开启 iso fluorine flow 时。大约一分钟后，将小鼠麻醉，并可以用连续的 iso 氟放置在手术台上。
因为自然自动发出荧光并可能掩盖生物发光图像，我们需要去除鼠标背面的毛发。最简单的方法是使用电动剃须刀，但您也可以使用脱毛凝胶，然后用酒精擦拭对皮肤进行消毒。接下来，在注射器中抽取 100 微升细胞悬液，23 至 27 号针头效果最好，因为它们不会堵塞细胞。
现在，将皮肤下的细胞注射到小鼠的背部，因为皮肤非常松弛。用拇指和食指捏住并伸展要注射的区域。在皮肤下注射，注意不要刺得太深。
此外，在按下柱塞的同时，尽量防止针头滑出注射部位。这将防止在皮肤上形成一个细胞可以泄漏的孔。如果您在注射细胞后尝试再次注射，请等待几个小时，让鼠标醒来并四处奔跑，然后再将其重新置于睡眠状态。
对于生物发光成像，这样做可以避免异氟醚毒性。好了，现在我们准备好对注射的细胞进行体内生物发光成像了。对于以下成像研究，我们将使用已经开始显示畸胎瘤形成的小鼠进行整个动物的生物发光成像。
我们以每公斤体重 375 毫克的剂量腹膜内注射 Lucifer。因此，我们需要称量麻醉动物的剂量，将 deed lucifer 注射到腹膜中，就在中线附近，拉回针头并确保没有血液，这将表明您的内部器官受损。如果鼠标开始唤醒，只需将其放回感应室并等待一两分钟即可。
将哑光黑纸放入成像盒中，以帮助吸收非人胚胎干细胞发出的任何光，从而准备成像。对于小鼠，最大生物发光信号通常发生在注射后 15 至 40 分钟。因此，10 到 15 分钟后，将鼠标背面朝上放入含有 iso 氟的成像室中。
从曝光时间 10 开始。如果信号饱和，请尝试减少曝光时间。如果太弱，则增加曝光。
为您的鼠标优化信号曝光时间后，开始每分钟拍摄一次图像，直到信号达到最大值。最好使用成像软件选择覆盖注射部位的感兴趣区域来完成。通过监测每个感兴趣区域的信号强度，您可以轻松确定信号何时开始减弱，表明已达到最大信号强度。
我们取在最大值附近出现的三个连续图像的平均值，并将其用作我们的最终值。当您对图像感到满意时，将鼠标从 isof fluorine 中取出并让它在笼子中唤醒。通常鼠标应在 15 分钟内唤醒。
在所需的生物发光时间进程之后，获取图像。可以在用于组织学的组织切片中处死动物。好了，现在我们已经完成了体内成像程序，我们可以仔细查看我们的结果，也可以查看我们实验室之前的一些研究。
这是三只患有皮下畸胎瘤的小鼠的生物发光图像。生物发光信号数据已叠加在成像软件自动为我们完成的小鼠黑白照片上。这是使用萤火虫荧光素酶可以进行纵向成像类型的一个例子。
在这种情况下，我们在初次注射后将人类胚胎干细胞直接注射到心脏中。大多数细胞在接下来的一周内死亡，如心脏上生物发光的减少所示。请注意，黑色箭头。
移植后存活下来的人胚胎干细胞最终会在心脏中形成畸胎瘤，从第 14 天左右开始，可以将其可视化为快速增加的信号。您会注意到，在第 7 天，红色箭头表示第二个生物发光区域，显示人类胚胎干细胞向腹部的额外心脏渗漏。这是很常见的。
我们刚刚向您展示了如何在体外和移植到活小鼠后获取稳定表达荧光素酶报告基因的人胚胎干细胞的生物发光图像。该方法允许对细胞增殖进行重复成像和监测，而无需牺牲大量动物进行组织学研究，而组织学本身对于细胞定量来说可能是不准确的。在小鼠中执行此程序时，请务必记住使用正确浓度的 delucci，并避免曝光间隔过长的生物发光图像饱和。
就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概述
本视频展示了一种使用生物发光成像技术在体内追踪人类胚胎干细胞增殖的协议。该方法允许在活体小鼠模型中对移植后的细胞行为进行无创评估。
关键研究组成部分
科学领域
- 干细胞研究
- 分子成像
- 移植生物学
背景
- 畸胎瘤的形成是干细胞多能性的关键指标。
- 了解畸胎瘤的生长动力学对于改善干细胞疗法至关重要。
- 当前的成像技术允许在体内追踪干细胞行为。
- 生物发光报告基因促进了对细胞位置和增殖的监测。
研究目的
- 提供详细的人类胚胎干细胞成像协议。
- 评估细胞在活体小鼠模型中的存活和增殖。
- 增强对移植后干细胞行为的理解。
使用的方法
- 生物发光报告基因转导。
- 超灵敏电荷耦合器件（CCD）摄影。
- 移植干细胞的体内成像。
- 细胞迁移和分化的评估。
主要结果
- 成功地在体内追踪人类胚胎干细胞的增殖。
- 展示了用于干细胞监测的无创成像技术。
- 对移植后干细胞行为的洞察。
- 为未来干细胞研究建立了协议。
结论
- 该协议提供了一种可靠的方法来监测干细胞行为。
- 生物发光成像对于评估体内细胞动力学是有效的。
- 本研究为干细胞疗法及其挑战的理解做出了贡献。
常见问题
Executive Industry Relevance
Bioluminescence reporter gene imaging enables non-invasive, longitudinal tracking of human embryonic stem cell (hESC) fate in vivo, addressing a critical challenge in regenerative medicine and cell therapy development. This approach provides quantitative, real-time insights into cell survival, proliferation, and teratoma formation, supporting predictive confidence and mechanistic de-risking at early discovery and preclinical inflection points. The method enhances portfolio decision-making by enabling robust assessment of cell-based therapeutic candidates in translational models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of hESC engraftment, survival, and proliferation in living systems.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing viable from non-viable transplanted cells via reporter gene expression.
- Facilitates functional validation of pluripotency and teratoma risk in candidate cell lines.
- Provides quantitative, time-resolved data to inform target confidence and triage decisions.
Screening & Assay Development
- Establishes validated, reproducible in vitro and in vivo imaging assays for cell tracking.
- Enables semi-quantitative correlation between cell number and bioluminescence signal for assay standardization.
- Supports scalable, high-throughput screening of cell survival and proliferation under varying conditions.
- Delivers robust readouts for compound or protocol optimization in cell-based workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vivo imaging outputs with disease-relevant models for translational continuity.
- Enables longitudinal monitoring of cell fate and teratoma formation in preclinical studies.
- Supports risk-adjusted advancement of cell therapy candidates based on real-time viability data.
- Provides a bridge from discovery to preclinical validation by enabling repeated, non-terminal assessments.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging platform integrates from early discovery through preclinical research, supporting hypothesis testing, mechanistic de-risking, and translational validation of hESC-based interventions.
- Discovery Biology: Quantifies cell survival and proliferation to clarify engraftment mechanisms and biological risk.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging assays for cell number and viability.
- Analytics: Provides longitudinal, semi-quantitative readouts for comparing experimental conditions and optimizing protocols.
- Translational Research: Enables non-invasive, repeated monitoring of cell fate in disease-relevant animal models.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable imaging capability applicable across diverse cell therapy programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell therapy R&D.
- Operational Value: Standardizes cell tracking workflows and minimizes animal use via non-terminal imaging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early detection of engraftment failure or teratoma risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of cell-based therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in reporter gene engineering and in vivo imaging instrumentation.
- Demands access to sensitive CCD imaging systems and validated luciferase reagents.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and quantitative analysis.
- Must be adapted for different cell types, promoters, and animal models as needed.
- Signal quantitation may be affected by tissue depth, probe delivery, and animal handling variables.
