蛋白质的电泳分离

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（又称PAGE），可以将复杂蛋白质混合物中的单个蛋白质分离。在电场作用下，蛋白质会穿过凝胶基质中的孔隙发生迁移。凝胶孔径大小以及蛋白质的电荷、大小和形状共同决定了蛋白质的迁移速率。在本视频中，我们将演示一种蛋白质电泳分离的方法。

大家好，我是来自凯克应用生命科学研究生院蛋白质组学中心的Dr. Bobul Chakravarti。今天我将向大家演示一维凝胶电泳的操作流程。现在就开始吧。

首先，使用两块干净的玻璃板和两片1.5毫米的间隔片，按照制造商的说明组装电泳装置的玻璃板夹心结构。然后将玻璃板夹心结构固定到制胶架上。接下来，配制分离胶溶液，其配方已在现有实验方案中描述。

加入指定量的10%过硫酸铵和TEMED至溶液中，轻轻搅拌混匀。由于丙烯酰胺浓度较高，无需脱气。使用10毫升一次性塑料移液管，立即沿其中一块隔片的边缘将分离胶溶液加至玻璃板夹层中，直至两块玻璃板之间的溶液高度约为11厘米。

接下来，使用另一支移液器缓慢地在凝胶顶部覆盖一层约一厘米厚的、经水饱和的异丁醇或蒸馏水。操作时，先轻轻将水沿一侧间隔片边缘加入，再沿另一侧间隔片边缘加入，使凝胶在室温下聚合 30 至 60 分钟。上层水相可确保丙烯酰胺凝胶聚合形成一条直线。

凝胶聚合后，我们即可准备灌注浓缩胶。首先，倒去上层的蒸馏水，然后用 pH 8.8 的 1× Tris-CL-SDS 缓冲液冲洗。现在，按照现行实验方案中的说明配制浓缩胶溶液。

接下来，使用塑料移液管，沿其中一块隔片的边缘将浓缩胶溶液缓慢滴加到夹心结构的中心位置，直至夹心中溶液的高度距离玻璃板顶部约1厘米处。注意避免将气泡引入浓缩胶中。胶溶液倒入后，立即将一支0.75毫米厚的聚四氟乙烯（Teflon）梳子插入浓缩胶溶液层中。

让浓缩胶溶液在室温下聚合30至45分钟，现在我们准备开始制备蛋白质样品。开始蛋白质样品制备时，取待分析的蛋白质样品部分，按1:1比例与2×SDS上样缓冲液稀释。

对于稀释的蛋白质溶液，建议使用五比一的蛋白质与六倍SDS上样缓冲液的混合物。如果样品为沉淀的蛋白质沉淀物，则将蛋白质溶解于50至100微升的一倍SDS上样缓冲液中。随后，将样品置于密封螺旋盖的微量离心管中，在100摄氏度的水浴中加热三至五分钟。

接下来，小心地移除聚四氟乙烯（Teflon）梳子，避免撕裂聚丙烯酰胺凝胶孔的边缘。移除梳子后，用1× SDS 电泳缓冲液冲洗孔道。然后使用移液器将1× SDS 电泳缓冲液加入孔道中。

当孔板冲洗完毕并加入缓冲液后，将凝胶夹心结构连接到上层缓冲液室。根据制造商说明书，向下层缓冲液室加入推荐体积的1×SDS电泳缓冲液。随后，将连接至上层缓冲液室的凝胶夹心结构放入下层缓冲液室中。

现在用一倍XSDS电泳缓冲液完全充满上层缓冲液室，使浓缩胶的加样孔内也充满缓冲液。此时凝胶已准备好上样，使用带有凝胶加样枪头的25或100微升移液器，将蛋白质样品小心地加至一个或多个加样孔底部，形成一层薄层。在对照孔中加入分子量标准品。

同时向任何空的加样孔中加入等体积的1×SDS上样缓冲液，以防止相邻泳道的样品扩散。现在我们可以开始进行凝胶电泳。运行凝胶时，将电源连接至电泳槽，并以30毫安恒定电流对厚度为1.5毫米的凝胶进行电泳。

当薄荷蓝示踪染料到达分离胶底部后，断开电源。此时凝胶电泳已经结束，弃去电泳缓冲液，并取下带有凝胶夹心结构的上层缓冲液室。调整凝胶方向，确保样品加样孔的排列顺序清晰可辨。

然后将夹心结构从上层缓冲液室中取出，平放在一张吸水纸或纸巾上。接着小心地将其中一个隔片从夹心结构边缘沿其整个长度方向滑出一半。利用暴露出来的隔片作为杠杆，小心地撬开玻璃板，从而暴露凝胶。

从下层玻璃板上取下凝胶。在凝胶的一个角上切去一个小三角形，以防止在染色和干燥过程中丢失加样孔的方向。至此，凝胶电泳步骤已完成。

现在可以使用多种蛋白质检测方法对凝胶进行后续处理。我们刚刚向您展示了如何利用凝胶电泳分离蛋白质。以上就是全部内容。

感谢观看，祝您的实验顺利。