Name: 电泳分离蛋白质 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-12T13:29:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 学习使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）技术分离蛋白质的方法。本视频演示了从凝胶制备、样品加载到电泳运行的完整流程，帮助研究人员掌握基于电荷和分子量分离蛋白质的关键技术。

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该实验方法的完整文字方案可在<a href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471142720/cp/cpmb/article/mb1002a/current/abstract" target="_blank">《分子生物学实验指南》</a>中获取。

作者无任何利益冲突需要披露。

蛋白质的电泳分离

Electrophoretic Separation of Proteins

电泳可用于分离复杂的蛋白质混合物（例如来自细胞、亚细胞组分、层析柱组分或免疫沉淀物的蛋白质），研究亚基组成，并验证蛋白质样品的均一性。此外，电泳也可用于纯化蛋白质，以供后续应用。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白质在电场作用下通过聚丙烯酰胺凝胶矩阵中的孔隙迁移；孔隙大小随丙烯酰胺浓度的增加而减小。蛋白质的迁移速率取决于孔隙大小以及蛋白质所带电荷、分子大小和形状。本单元介绍在变性条件下（即在十二烷基硫酸钠（SDS）存在下）进行不连续凝胶电泳的标准Laemmli方法。

在本视频中，我们演示了一种利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行蛋白质电泳分离的方法。

电泳用于分离复杂的蛋白质混合物（例如来自细胞、亚细胞组分、层析柱组分或免疫沉淀物中的蛋白质），以……

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（又称PAGE），可以将复杂蛋白质混合物中的单个蛋白质分离。在电场作用下，蛋白质会穿过凝胶基质中的孔隙发生迁移。凝胶孔径大小以及蛋白质的电荷、大小和形状共同决定了蛋白质的迁移速率。在本视频中，我们将演示一种蛋白质电泳分离的方法。大家好，我是来自凯克应用生命科学研究生院蛋白质组学中心的Dr. Bobul Chakravarti。今天我将向大家演示一维凝胶电泳的操作流程。现在就开始吧。首先，使用两块干净的玻璃板和两片1.5毫米的间隔片，按照制造商的说明组装电泳装置的玻璃板夹心结构。然后将玻璃板夹心结构固定到制胶架上。接下来，配制分离胶溶液，其配方已在现有实验方案中描述。加入指定量的10%过硫酸铵和TEMED至溶液中，轻轻搅拌混匀。由于丙烯酰胺浓度较高，无需脱气。使用10毫升一次性塑料移液管，立即沿其中一块隔片的边缘将分离胶溶液加至玻璃板夹层中，直至两块玻璃板之间的溶液高度约为11厘米。接下来，使用另一支移液器缓慢地在凝胶顶部覆盖一层约一厘米厚的、经水饱和的异丁醇或蒸馏水。操作时，先轻轻将水沿一侧间隔片边缘加入，再沿另一侧间隔片边缘加入，使凝胶在室温下聚合 30 至 60 分钟。上层水相可确保丙烯酰胺凝胶聚合形成一条直线。凝胶聚合后，我们即可准备灌注浓缩胶。首先，倒去上层的蒸馏水，然后用 pH 8.8 的 1× Tris-CL-SDS 缓冲液冲洗。现在，按照现行实验方案中的说明配制浓缩胶溶液。接下来，使用塑料移液管，沿其中一块隔片的边缘将浓缩胶溶液缓慢滴加到夹心结构的中心位置，直至夹心中溶液的高度距离玻璃板顶部约1厘米处。注意避免将气泡引入浓缩胶中。胶溶液倒入后，立即将一支0.75毫米厚的聚四氟乙烯（Teflon）梳子插入浓缩胶溶液层中。让浓缩胶溶液在室温下聚合30至45分钟，现在我们准备开始制备蛋白质样品。开始蛋白质样品制备时，取待分析的蛋白质样品部分，按1:1比例与2×SDS上样缓冲液稀释。对于稀释的蛋白质溶液，建议使用五比一的蛋白质与六倍SDS上样缓冲液的混合物。如果样品为沉淀的蛋白质沉淀物，则将蛋白质溶解于50至100微升的一倍SDS上样缓冲液中。随后，将样品置于密封螺旋盖的微量离心管中，在100摄氏度的水浴中加热三至五分钟。接下来，小心地移除聚四氟乙烯（Teflon）梳子，避免撕裂聚丙烯酰胺凝胶孔的边缘。移除梳子后，用1× SDS 电泳缓冲液冲洗孔道。然后使用移液器将1× SDS 电泳缓冲液加入孔道中。当孔板冲洗完毕并加入缓冲液后，将凝胶夹心结构连接到上层缓冲液室。根据制造商说明书，向下层缓冲液室加入推荐体积的1×SDS电泳缓冲液。随后，将连接至上层缓冲液室的凝胶夹心结构放入下层缓冲液室中。现在用一倍XSDS电泳缓冲液完全充满上层缓冲液室，使浓缩胶的加样孔内也充满缓冲液。此时凝胶已准备好上样，使用带有凝胶加样枪头的25或100微升移

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科研

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生物学

电泳分离蛋白质

本视频展示了一种基于变性聚丙烯酰胺的蛋白质分离技术。该技术可根据蛋白质的分子量对其进行初步鉴定。...

基于分子量分离与可视化蛋白质的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳技术：用于蛋白质分析

本视频介绍了用于从组织匀浆中分离天然蛋白质复合物的多聚体PAGE技术。该技术是蓝色天然PAGE与SDS-PAGE技术的结合。分离得到的复合物可用于表征并研究其在细胞功能中的作用。...

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二维聚丙烯酰胺凝胶电泳：一种基于电荷和分子量分离复杂蛋白质混合物中蛋白质的分析技术

本方案描述了如何制备并实施透明天然凝胶洗脱液相分离电泳（CN-GELFrEE），这是一种适用于从异质样品中分离非共价生物分子复合物和蛋白质的天然分离技术，且可与多种下游蛋白质分析技术兼容。...

CN-GELFrEE - 清亮天然凝胶洗脱液相组分捕获电泳

通过电泳方法分离后，凝胶中的蛋白质可通过多种染色方法进行检测。本视频展示了使用考马斯亮蓝、银染法、SYPRO Orange 和 SYPRO Ruby...

凝胶中蛋白质的染色

微接触印刷技术被广泛用于在材料表面图案化蛋白质及其他分子。我们演示了该过程的基本步骤，即将纤连蛋白图案印制到玻璃表面。...

用于细胞生物学的蛋白质微接触印刷技术

衣藻（Chlamydomonas reinhardtii） 的交配与四分孢子分离用于遗传学分析

从大鼠股骨和胫骨中分离出MSCs，并通过磁性细胞分选进行富集。通过流式细胞术确认分选细胞表面标志物的表达。这些细胞还在克隆密度下培养以形成单个克隆，然后使用克隆环分离这些克隆。...

大鼠间充质干细胞（MSCs）的分离与富集及单克隆来源MSCs的分离

本方案描述了从膜蛋白在立方相脂质中的重组开始，获得可用于衍射分析的晶体所需的关键步骤，包括利用LCP-FRAP预结晶实验筛选初始条件、设置LCP结晶试验以及晶体的收获。...

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钙调蛋白（CaM）下拉实验是研究CaM与多种蛋白质相互作用的有效方法。该方法利用CaM-琼脂糖...

钙调蛋白结合蛋白的下拉实验

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蛋白质的电泳分离

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