在凝胶染色蛋白质
2008年7月8日
蛋白质凝胶电泳方法分离，可以检测到几种染色方法。 SYPRO Ruby的SYPRO橙，银染，考马斯亮蓝蛋白染色在这个视频演示。
在上一个题为"蛋白质的电泳分离"的视频中，我们演示了如何使用凝胶电泳分离复杂的蛋白质混合物。在本视频中，我们将向您展示四种不同的凝胶染色方法，用于可视化凝胶中蛋白质的位置。大家好，我是来自 UVP 的 Sean Gallagher，在 KEG 研究生院的蛋白质组学中心工作。
今天，我将向您展示一些通过电泳分离后可视化蛋白质的技术。这包括 Kamasi 蓝银染色、cyro orange 和 cyro ruby。那么，让我们先从 Kamasi blue 开始。
通过 Kamasi 蓝染色检测凝胶中的蛋白质禁令取决于染料的非特异性结合。在这种情况下，Kamasi 亮蓝色 G 二 50。在这种方法中，使用高纯度水洗涤在聚丙烯酰胺凝胶中分离的蛋白质。
然后使用水基 kamasi 蓝染色剂检测蛋白质的位置。检测限为每个蛋白质条带 0.3 至 1 μg。首先，从聚丙烯酰胺凝胶开始，其中蛋白质已通过电泳分离。
在缓慢搅拌的同时，将聚丙烯酰胺凝胶放入装有 300 毫升高纯水的塑料容器中。静置 5 分钟。丢弃并在第三次洗涤后再重复两次。
倒出水，用 Kamasi 蓝染色液覆盖凝胶一小时，同时缓慢搅拌染色一小时后，倒出染色液。将凝胶放入约 200 毫升水中 30 分钟，短暂冲洗凝胶。此时，凝胶可以储存在水中以备将来成像。
凝胶也可以在此阶段干燥以保持永久的凝胶记录。为此，将凝胶放在两张 Watman 3 毫米滤纸上，并用保鲜膜覆盖顶部。然后在传统的凝胶干燥器中以大约 80 摄氏度干燥 1 到 2 小时。
另一种蛋白质染色方法是银染，我们接下来将演示。尽管 Kamasi 蓝染色方法更容易、更快速，但银染的灵敏度要高得多，检测限为 0.3 纳克 BSA。银染检测凝胶中的蛋白质条带取决于银与蛋白质中各种化学基团的结合。
以下实验方案基于 in Vitrogen 的 Silver Quest 银染试剂盒。该方案源自快速染色方案，大约需要 30 分钟，是用于银染的众多基于试剂盒的化学试剂之一，与质谱兼容。在这种情况下，我们将在开始银染之前使用体外预制小型凝胶。
确保始终戴手套，以避免指纹污染。将凝胶放入装有 100 毫升试剂级水的微波炉安全托盘中。短暂冲洗，然后倒掉水。
接下来，加入 100 毫升固定剂，由 40% 乙醇、10% 乙酸组成的高纯水溶液，微波 30 秒。微波过程通过加速结合和染色来缩短必要的孵育步骤。此时，将凝胶放在摇摇器上，慢慢摇动 5 分钟。
5 分钟后，倒出固定剂，加入 100 毫升、30% 乙醇，用微波炉洗涤凝胶 30 秒，然后将凝胶放在摇床上 5 分钟。五分钟后，倒出乙醇。现在加入 100 毫升致敏试剂微波 30 秒，然后放在摇床上 2 分钟。
两分钟后，倒掉致敏试剂。加入 100 毫升试剂级水微波 30 秒，然后放在摇床上 2 分钟。倒出并重复总共两个洗涤周期。
现在加入 100 毫升染色液，微波 30 秒，然后缓慢搅拌 5 分钟。5 分钟后，倒出染色液。加入 100 毫升试剂级水，跳过微波炉，直接放在摇床上 20 至 60 秒。
弃去水，立即加入 100 毫升显影液并显影，直到蛋白质条带可见。在背景保持清晰的情况下，这大约需要 5 到 10 分钟。此时，向显影剂中加入 10 毫升的塞子溶液，以阻止发展以获得最佳效果。
请尽快拍摄滤色片，因为颜色强度可能会有轻微变化，非特异性背景元素可能会增加。随着时间的推移，您看到的凝胶含有残留蛋白质电印迹后，干燥凝胶以保持永久记录或存放在可密封的塑料袋中。接下来，我们演示了一种对凝胶进行荧光染色的方法。
与传统蛋白质染料相比，荧光染料具有许多优势。我们将在此处概述的 Cipro orange 蛋白质凝胶染色剂可以检测每个条带 1 到 2 ng 的蛋白质。这比 kamasi 亮蓝染色更敏感，与许多银染技术一样敏感。
荧光染色简单明了，比典型的银染方案少，手动作时间更短，并且在一小时内完成。染色的蛋白质可以使用标准的 300 纳米紫外透射仪或激光扫描仪进行可视化。在这种情况下，我们将再次使用体外预制微型凝胶开始使用 SDS 页面制备和分离蛋白质。
但是在运行缓冲液中使用 0.05% SDS 而不是通常的 0.1%SDS，以减少背景荧光。开始染色程序时，将 cipro orange 荧光染色溶液倒入一个小塑料皿中，用于制备 1 块或 2 块标准尺寸的小型凝胶。使用约 50 毫升染色液。
重要的是要注意，染色的餐具在使用前应进行清洁和冲洗，因为任何洗涤剂都会干扰染色。现在，将凝胶放入染色溶液中。用铝箔覆盖容器，以保护染料免受强光照射。
在室温下轻轻搅拌凝胶 40 至 60 分钟。弃去染色液，然后用 7.5% 乙酸冲洗凝胶不到 1 分钟，约 100 毫升以去除凝胶表面多余的污渍，通过在 0.1% 吐温 20 中孵育过夜来保留凝胶，以观察和拍摄蛋白质条带。将荧光标记的凝胶直接放在标准的 300 纳米透射器或蓝光透射器上。
接下来，我们将演示另一种荧光染色方法，该方法使用 Cipro 红宝石荧光染料。Cipro 红宝石染色方法专为二维页面而设计，但已被证明是标准一维 SDS 页面最敏感的蛋白质凝胶染色剂。首先，将凝胶转移到适当大小的干净聚丙烯或 PVC 培养皿中。
将凝胶放入适量未稀释的 cipro ruby 蛋白凝胶染料中，在轨道振荡器上以 50 RPM 的速度连续轻轻搅拌。盖上凝胶并孵育至少三个小时。将凝胶转移到干净的染色皿中，在 10% 甲醇、7% 乙酸溶液中洗涤一次，回收并将凝胶放回摇杆上 30 分钟。
为了减少背景荧光并提高灵敏度，现在可以查看和拍摄凝胶。感谢大家今天收看今天的协议。我们向您展示了电泳后蛋白质可视化的多种不同程序。
有些非常敏感，如荧光染色和银染，有些是常规的，如卡马西蓝染色。重要的是要记住，试剂纯度至关重要。使用超纯水也非常重要，每个步骤的时间安排也非常重要。
您需要密切关注这一点，以便获得可重复的结果。就是这样，祝你下一组实验好运。
概述
本视频演示了电泳分离后可视化蛋白质的各种凝胶染色方法。技术包括考马斯亮蓝染色、银染色、SYPRO橙和SYPRO红。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 蛋白质组学
- 电泳
背景
- 凝胶电泳是一种常见的分离蛋白质的方法。
- 染色方法对于可视化分离的蛋白质至关重要。
- 不同的染色技术在灵敏度和易用性上有所不同。
- 本视频在之前的蛋白质分离演示基础上进行。
研究目的
- 展示多种蛋白质可视化染色技术。
- 比较每种方法的效果和灵敏度。
- 为蛋白质组学研究者提供实用指南。
使用的方法
- 考马斯亮蓝染色用于一般蛋白质检测。
- 银染色用于增强蛋白质可视化的灵敏度。
- SYPRO橙和SYPRO红用于荧光检测。
- 协议包括凝胶的制备、染色和成像。
主要结果
- 考马斯亮蓝提供了一种快速简单的蛋白质检测方法。
- 银染色具有更高的灵敏度，能检测到较低的蛋白质浓度。
- 像SYPRO橙这样的荧光染色剂灵敏且需要较少的人工时间。
- 每种方法根据研究需求具有独特的优势。
结论
- 电泳后有多种染色技术可用于蛋白质可视化。
- 研究者应根据灵敏度和易用性选择方法。
- 了解这些技术可以增强蛋白质样品的分析。
常见问题
Executive Industry Relevance
Reliable protein visualization following electrophoretic separation is foundational for early discovery, assay development, and translational workflows in biopharma R&D. The choice of staining method directly impacts sensitivity, reproducibility, and downstream analytical confidence, influencing target validation and screening decisions. Standardized, high-sensitivity staining protocols enable robust data generation and portfolio triage across discovery and preclinical inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Supports detection and quantification of protein targets post-separation for hypothesis testing.
- Enables assessment of protein expression and purity critical for target validation.
- Facilitates mechanistic de-risking by confirming presence and integrity of candidate proteins.
Screening & Assay Development
- Provides validated visualization of proteins for assay standardization and reproducibility.
- Enables selection of staining protocols based on required sensitivity for screening campaigns.
- Supports quantitative comparison of protein bands, informing assay optimization.
Translational & Preclinical Research
- Allows sensitive detection of low-abundance proteins relevant to disease models.
- Ensures continuity of protein analytics from discovery through preclinical validation.
- Reduces risk of false negatives in biomarker or target assessment workflows.
Pipeline & Workflow Integration
Protein staining methods are positioned immediately after electrophoretic separation, bridging discovery biology and analytical workflows. Selection of staining technique informs downstream quantitation, mass spectrometry compatibility, and data reproducibility.
- Discovery Biology: Confirms protein separation and supports null hypothesis testing for target presence.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative band visualization for assay readiness.
- Analytics: Provides sensitivity thresholds and imaging outputs for comparative analysis.
- Translational Research: Maintains analytical continuity for biomarker and target validation.
- Enterprise Reuse: Standardized protocols enable cross-project and cross-team adoption.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in protein detection.
- Operational Value: Enables reproducible, scalable workflows with clear sensitivity benchmarks.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and efficient resource allocation.
- Portfolio Impact: Enhances risk-adjusted prioritization by ensuring robust protein analytics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophoresis and staining protocol execution.
- Demands access to high-purity reagents, imaging systems, and controlled environments.
- Necessitates strict timing and handling to ensure reproducibility and sensitivity.
- Protocols must be adapted for compatibility with downstream mass spectrometry or fluorescence imaging.
- Attention to reagent purity and protocol timing is critical for consistent results.
