电穿孔分枝杆菌
May 23rd, 2008
结核分枝杆菌的致病性战略仍然知之甚少。品种最缓慢的增长速度，细胞壁的坚不可摧的性质，和病原体的危害，使分枝杆菌的研究和主要负责为我们这些生物体缺乏了解。在这个视频中，我们将演示电的技术，它涉及到一个简短的电脉冲，让遭受细胞DNA的条目。它是最广泛使用的方法引入分枝杆菌细胞的DNA。
分枝杆菌致病策略对大多数物种的缓慢生长速度仍然知之甚少。细胞壁的不可穿透性和与病原体一起工作的危害使分枝杆菌难以研究，并且是我们对这些生物体了解不足的主要原因。在本视频中，我们将演示电穿孔技术，该技术涉及使细胞受到短暂而强烈的电脉冲，从而允许 DNA 进入。
它是在分枝杆菌细胞中引入 DNA 的最广泛使用的方法。嗨，我是来自 Tanya Parish 实验室的 Ron Good，来自 Bats 传染病中心和伦敦医学和牙科学院。今天我们将向您展示电作微生物的程序。
在我们的实验室，我们研究结核微菌，但由于它具有高度致病性并且需要 C3 密封设施，我们将在非致病性微菌 m Mcma 中向您展示这项技术。所以让我们电吃一些细菌。要吃分枝杆菌，我们需要制造感受态细胞。
重要的是要记住，病原分枝杆菌是一种重要的生物危害。因此，所有培养和基因作必须在适当的收容中进行。一级安全柜内的设施 风险评估必须构成任何病原分枝杆菌实验的第一部分。
为了制作这些，我们首先在固体培养基上保持培养，例如 lemko、auger suculate、5 mils Lemko，其中包含带有一个充满分枝杆菌的循环的补间肉汤。由于许多分枝杆菌生长相对较慢，因此生物体对于保持良好的无菌技术以防止这些培养物被真菌细菌污染极为重要，这些真菌细菌可以迅速生长出分枝杆菌。设置重复的培养物通常是明智的，以防一种培养物被污染。
分枝杆菌细胞由于其厚厚的蜡质外套，在培养物中倾向于聚集在一起。涡旋和添加非离子去污剂（如 Tween 82 培养基）可减少这种结块，并提供更均匀的细胞悬液。接种后，将培养物在 37 摄氏度下孵育，并以 100 RPM 振荡过夜。
发酵剂培养物生长后，在 250 mil 锥形瓶中接种约 100 mil 的 lemko tw 的大规模培养物，并加入 1 比 100 稀释的过夜培养物。继续在 37 摄氏度下振荡孵育约 16 至 24 小时，此时可以使用分光光度计检查光密度。如果读数为 0.8 比 1，则细胞处于最佳对数生长期。
之后，在收获前将细胞在冰上孵育 1.5 小时，这将有助于将转化效率提高四倍。长。在冰上孵育会导致效率降低。接下来，通过将培养物倒入大离心管中来收获细胞。
离心后以 300 G 离心 10 分钟，在冰冷的环境中洗涤细胞 3 次，每次 10% 甘油减少体积，因此对于 1000 餐的培养体积，第一次洗涤使用 20 餐，然后是 10 密耳，最后是 5 密耳最后一次洗涤。洗涤后，复苏将细胞悬浮在原始冰冷体积的 1 到 10 到 1 到 10 中。10% 甘油在此阶段，可以将细胞分装、冷冻并储存在零下 70 摄氏度以备将来使用。
冷冻细胞后，转化效率通常会提高。在使用这些感受态细胞之前，应将其解冻，通过离心收获，并在使用前重悬于新鲜的 10% 甘油中。为了进行电游行，ems mag an electro，这是一种可以提供 2.5 高压脉冲的设备。
使用千伏。将细菌和 DNA 置于电穿孔、比色皿中。尽管不同比色皿的间隙或光程可能相同，但它们会根据它们可以容纳的体积而变化。
我们通常使用 200 μL 的 0.2 μL 细胞来吃掉细胞。首先，制备 DNA 样品，使其不含盐和其他污染物。这对于最大限度地减少电穿孔过程中电弧的机会非常重要。
在对细菌进行钻孔之前，请确保您的 DNA 样品纯度高。两个 60 对两个 80 的吸收比应接近 1.8。将 0.5 至 5 μg 体积不超过 5 μL 的无盐 DNA 添加到 200 μL 微细菌悬液中，可以包括无 DNA 的对照电穿孔，以检查抗生素耐药突变体的频率。
然后将混合物放在冰上 10 分钟。这将减少样品中活细胞的存在和 DNA 溶液中的盐的存在，从而最大限度地减少冰孵育后的电弧，在高压脉冲之前用移液管或涡旋彻底重新分布细胞，以重悬细胞并确保 DNA 的混合。细胞的任何聚集都会导致电弧并降低转化效率。
接下来，将混合物转移到预冷的 0.2 厘米电极 gab qve 中。同样，注意不要在混合物中引入任何气泡。也是为了减少电弧。
在将 qve 放入脉冲室之前，请确保 qve 的外部完全干燥。彻底干燥 qve 并将脉冲控制器电阻设置为 1000 欧姆后，将 qve 放入电穿孔室中。然后将电压设置为 2.5 千伏后，施加脉冲直到发出哔哔声，表明 QVE 中的电容器已放电。
大于 10 的时间常数表示电穿孔成功。电穿孔不成功通常由电弧指示，电弧会产生火花，这通常可以避免。通过改变脉冲控制器上的电阻，将 Q vet 放回冰上 10 分钟。
孵育后，将细胞悬液转移至装有 5 mil lemko TW 肉汤的无菌通用瓶中。重要的是在脉冲后立即将细胞稀释至少 10 倍，以帮助细胞恢复并提高转化体的存活率。接下来，将细胞在 37 摄氏度下孵育 2 到 3 小时，然后它们可以在孵育后进行接种，通过在 3000 G 离心 10 分钟来收获细胞。
离心后，在 lemko 肉汤中适当稀释悬浮液，使每个板获得 30 至 300 个菌落。确保从单个细胞中产生抗性集落非常重要，因此请确保在铺板前彻底重悬细胞。如果细胞没有被稀释，则很难在背景下看到真正的耐药性菌落。敏感细胞的草坪现在用适当的抗生素在 lemko 螺旋钻上接种细胞。
他们在 37 摄氏度下孵育板，直到菌落变得可见。这将在菌落生长后三到五天。数一数转化体。
计算转换效率。有几个因素会影响转换的效率。这些指标包括收获电穿孔培养基时细胞的生长期，以及输送脉冲的场强和时间常数。
电穿孔技术的效率还取决于用于转化的 DNA 的选择，有时还取决于可选择标记物的选择。我们通常使用潮霉素或链霉素在 ems 岩浆中抗性获得每微克 DNA 10 到 5 个、10 到 6 个菌落的效率。现在，为了生长，转化体将电穿孔分枝杆菌划线到固体培养基上，再进行选择。
抗生素在 37 度下孵育 2 到 3 天。孵育 2 到 3 天后，您可以根据大多数应用的要求分析转化体，应划线取出三个转化体并进行分析。转化后检查额外染色体质粒的身份很重要。
由于缺失和重排很常见，我刚刚向您展示了如何电解质分枝杆菌 s 岩浆。如果您要对病原微生物进行此程序，请记住使用适当的安全措施。就是这样。
感谢您的观看，祝您的实验好运。
概述
本文讨论了由于分枝杆菌的生长缓慢和细胞壁复杂而导致的研究挑战。它强调了将DNA引入分枝杆菌细胞的电穿孔技术。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 基因工程
- 病原体研究
背景
- 由于分枝杆菌的致病性，它们难以研究。
- 生长速度缓慢使研究工作复杂化。
- 电穿孔是基因操作的关键方法。
- 在处理致病菌株时，安全预防措施至关重要。
研究目的
- 展示分枝杆菌的电穿孔技术。
- 提高对分枝杆菌遗传学的理解。
- 提供安全操作分枝杆菌细胞的协议。
使用的方法
- 制备能够接受电穿孔的分枝杆菌细胞。
- 使用高压脉冲进行电穿孔。
- 电穿孔后细胞的孵化和收获。
- 转化效率的评估。
主要结果
- 成功地将DNA引入分枝杆菌细胞中。
- 通过特定协议提高了转化效率。
- 展示了处理致病菌株的安全实践。
- 建立了可重复的电穿孔方法。
结论
- 电穿孔对分枝杆菌的基因操作是有效的。
- 安全和无菌技术在分枝杆菌研究中至关重要。
- 进一步的研究可以增进对分枝杆菌致病机制的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Efficient genetic manipulation of mycobacteria is a critical bottleneck in infectious disease research and early-stage drug discovery, due to the organism's robust cell wall and slow growth. Electroporation enables reliable DNA delivery, supporting target validation and mechanistic studies in both non-pathogenic and pathogenic mycobacterial species. This capability advances predictive confidence at the discovery inflection point and underpins translational research continuity for tuberculosis and related pathogens.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of mycobacterial genes for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by facilitating genetic knock-in or knock-out studies.
- Improves predictive confidence in pathway analysis for infectious disease models.
Screening & Assay Development
- Prepares genetically modified strains for downstream phenotypic screening.
- Standardizes transformation protocols to ensure reproducibility across experiments.
- Delivers quantitative outputs through selectable marker-based colony counting.
Translational & Preclinical Research
- Enables creation of disease-relevant mycobacterial models for preclinical validation.
- Facilitates continuity from genetic manipulation to in vivo or ex vivo studies.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing robust genetic tools.
Pipeline & Workflow Integration
Electroporation-based transformation integrates at the interface of early discovery and preclinical model development, enabling hypothesis testing and genetic tool generation for lead identification and validation.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis-driven gene function studies and pathway mapping.
- Screening: Delivers reproducible, selectable outputs for compound evaluation in engineered strains.
- Analytics: Enables quantitative assessment of transformation efficiency and genetic modification success.
- Translational Research: Bridges genetic manipulation with disease-relevant model creation for downstream studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable protocol applicable across mycobacterial species and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mycobacterial research.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable transformation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and reduces late-stage biological risk in infectious disease portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of mycobacterial targets and models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in aseptic technique and biosafety for pathogenic strains.
- Needs access to electroporation instrumentation and analytical tools for DNA purity assessment.
- Demands cross-team standardization of transformation parameters and selectable markers.
- Must adapt protocols for species- or strain-specific growth and transformation characteristics.
- Efficiency is influenced by cell growth phase, DNA quality, and electroporation conditions.
