Name: 小鼠表皮神经嵴干细胞（EPI的非公务员合约雇员）文化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-09T01:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 学习从小鼠触须毛囊中分离表皮神经嵴干细胞（EPI-NCSC）的培养方法。该技术通过显微解剖隆突组织并在体外培养，可在3至4天内获得高迁移性干细胞，为神经发育和再生医学研究提供可靠的细胞来源。

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资助来源：美国国立卫生研究院（NIH）下属国家神经疾病与卒中研究所（NINDS）USPHS基金NS38500；美国威斯康星州东南部生物医学技术联盟，密尔沃基，威斯康星州，美国；美国密尔沃基市布赖恩·里施瘫痪基金会；美国鹰友会中西部分会；美国国家脊髓损伤协会密尔沃基分会；英国纽卡斯尔大学东北英格兰干细胞研究所。

成年小鼠胡须毛囊隆突区的分离
<ol>
<li>我们使用 10 周至 6 个月大的小鼠。较年轻的小鼠通常能获得更多的细胞。处死小鼠后，将整个动物浸入 1:1 的聚维酮碘（碘溶液）与过氧化氢（可从药店获得）混合液中，约 3 分钟。 </li>
<li>用 75% 乙醇喷洒整个小鼠，尤其是面部区域，然后将小鼠转移至层流罩内的解剖显微镜下操作。</li>
<li>解剖分离胡须垫组织，注意避免切到毛囊球，并将组织收集至 HBSS 中。</li>
<li>在室温下解剖胡须毛囊并收集至 HBSS 中。操作时用镊子夹住毛囊旁的皮肤，用直头剪刀围绕毛囊进行剪切。剪切时应较深，以避免损伤毛囊球。</li>
<li>将胡须毛囊从胡须垫中取出，放入含有新鲜 HBSS 的新培养皿中。</li>
<li>用缓冲液反复冲洗，去除松散的脂肪和真皮组织，直至胡须毛囊清洁。如有必要，切断通向毛囊的神经，并通过刮除及重复冲洗 HBSS 去除附着的组织。</li>
<li>使用 sharpened tungsten 针将清洁的毛囊固定在 Sylgard 涂层的玻璃培养皿上，用显微镊夹住毛囊旁的皮肤部分以固定。</li>
<li>用显微刀片纵向切开胡须毛囊。注意不要切得太深，以免损伤隆突区（bulge）。用 HBSS 反复冲洗去除血液，直至无血。出现血液是切割深度足够的良好标志。如果纵向切口长度不足，可用弯头显微剪刀延长切口。</li>
<li>在海绵窦水平以上做一横向切口，随后在靠近皮肤的环窦水平处做第二道横向切口。</li>
<li>此时可在毛囊囊内观察到隆突区（bulge）。</li>
<li>用镊子夹住胶原囊的一端，用弯头钨针将隆突区向外卷出。此时可见空的囊结构和分离出的隆突区。</li>
<li>将分离出的隆突区收集至另一含有 HBSS 的培养皿中，室温保存。确保收集的隆突区中无其他组织污染。</li>
</ol>
隆起区外植体的培养
<ol>
<li>用胶原蛋白包被35 mm培养皿：将50 µl胶原蛋白和10 µl无菌6% NaCl并排加入培养皿中，使用双弯巴斯德吸管充分混合，并将液体推向培养皿边缘。在洁净的干燥器中孵育过夜，但不要使其干燥。使用前用生理盐水冲洗培养皿。</li>
<li>将包被胶原蛋白并冲洗后的培养皿用培养基预孵育约3小时。培养基由85% α-修饰最低必需培养基（Alpha-modified MEM）、10%胎牛血清和5%第11天鸡胚提取物组成。</li>
<li>再次孵育后，从培养皿中移除培养基，并加入含尽可能少培养基的毛囊隆突外植体。去除多余的培养基。</li>
<li>在细胞培养箱中，于含10%氧气和5% CO2的湿润气氛中孵育1小时，不得超过该时间。</li>
<li>1小时后，轻柔加入1.5 ml培养基。隆突外植体应黏附于胶原基质上。每天更换50%的培养基。</li>
<li>在3&nbsp;– 4天内，高迁移性细胞将从隆突外植体迁移而出。注意其星状形态、运动能力以及细胞间接触的显著缺乏。在随后几天内，将有更多细胞迁移出来，且已迁移的细胞会迅速增殖。</li>
<li>在EPI-NCSC开始迁移后的2&nbsp;– 3天，使用锋利的钨针移除隆突组织。若隆突组织保留时间过长，其倾向于变平，导致无法获得纯的EPI-NCSC培养物。</li>
<li>重要提示：少数形态扁平的细胞可能在EPI-NCSC出现数天后才显现，且运动性较低，这些细胞不是EPI-NCSC，而是假定的表皮干细胞/前体细胞。由这类细胞构成的培养物，或含有EPI-NCSC与假定表皮干细胞/前体细胞的混合培养物，均应弃用。</li>
<li>提示：不要将细胞在初级外植体培养基中维持过长时间，因为在高细胞密度下，细胞倾向于快速分化，可能与自分泌/旁分泌生长因子信号有关。</li>
</ol>

<ol><li>Sieber-Blum, M., Grim, M., YF, H. u, Szeder, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+neural+crest+stem+cells+in+the+adult+hair+follicle%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Pluripotent neural crest stem cells in the adult hair follicle.</a> Dev. Dyn. 231, 258-269 (2004).</li>
<li>Sieber-Blum, M., Grim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+hair+follicle+-+cradle+for+pluripotent+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+%28Part+C%29%22%5BJournal%5D)">The adult hair follicle - cradle for pluripotent neural crest stem cells.</a> Birth Defects Research (Part C). Tuan, R., Grim, M. 72, 162-172 (2004).</li>
<li>Sieber-Blum, M., Schnell, L., Grim, M., Schneider, R., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+epidermal+neural+crest+stem+cell+%28EPI-NCSC%29+grafts+in+the+lesioned+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Pub%22%5BJournal%5D)">Characterization of epidermal neural crest stem cell (EPI-NCSC) grafts in the lesioned spinal cord.</a> Pub. 32, 67-81 (2006).</li>
<li>Hu, Y. F., Zhang, Z. -J., Sieber-Blum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epidermal+neural+crest+stem+cell+%28EPI-NCSC%29+molecular+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">An epidermal neural crest stem cell (EPI-NCSC) molecular signature.</a> Stem Cells. 24, Epub ahead of print 2692-2702 (2006).</li>
</ol>

由于具有迁移能力，EPI-NCSC 可被分离为高纯度的干细胞群体，并可在体外进行扩增。作为存在于成体部位的胚胎残留细胞，EPI-NCSC 在未来的细胞替代治疗、生物医学工程和/或再生医学中具有潜在的应用前景。我们已在脊髓损伤的小鼠模型中测试了 EPI-NCSC，结果显示其具备理想的特性。通过 LongSAGE 基因表达谱分析（www.ncbi.nlm.nih.gov/geo，系列编号 GSE4680）发现，正如预期，胚胎神经嵴细胞与 EPI-NCSC 具有相似的基因表达模式，而该模式不同于邻近的表皮干细胞及其他皮肤驻留干细胞/前体细胞的表达模式。

小鼠表皮神经嵴干细胞（epi-ncsc）培养

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC 是存在于成体毛囊隆突区的胚胎神经嵴残余细胞。它们是一类多能干细胞，具有生成多种分化细胞类型的生理特性，包括神经元、神经支持细胞、平滑肌细胞、骨/软骨细胞以及黑色素细胞。EPI-NCSC 易于从有毛皮肤获取，并可分离为高纯度的干细胞群体。本视频详细展示了从小鼠胡须毛囊制备 EPI-NCSC 培养物的实验方案。取成年小鼠的胡须垫组织，解剖分离出胡须毛囊；将毛囊在隆突区域上下纵向切开，再作横向切割；取出隆突区的细胞，脱离胶原囊后置于培养板中。3 至 4 天后，EPI-NCSC 开始从隆突外植体迁移出来。

本文介绍了我们分离小鼠表皮神经嵴干细胞（EPI-NCSC）的方法。该技术包括显微解剖小鼠须毛毛囊，分离毛囊隆突区，并将其置于组织培养环境中。EPI-NCSC 通常在 3 至 4 天内开始从隆突区外植块迁移至培养基质表面。

小鼠表皮神经嵴干细胞（EPI-NCSC）培养

EPI-NCSC 是存在于成人毛囊隆突部位的胚胎神经嵴残余。它们是具有多向分化潜能的干细胞，能够……

大家好，我是来自纽卡斯尔大学人类遗传学研究所和东北英格兰干细胞研究所的Maya Sibu Bloom。这位来自威斯康星医学院。今天我们将向您展示我们从小鼠窦状卵泡制备卵泡外植体（Al Explan）的操作流程。B区膨大是制备表皮神经嵴干细胞培养物的起始组织。该操作步骤包括解剖小鼠的须垫，显微解剖毛囊，随后分离B区膨大，并将其置入培养板中。现在我们开始操作。该操作首先从成年小鼠的胡须毛囊中分离隆突区。通常我们使用两个月至六个月大的小鼠，但较年轻的小鼠往往能获得更多的干细胞。将动物麻醉后完全浸入等体积混合的聚维酮碘和过氧化氢溶液中约三分钟进行消毒，随后用75%乙醇冲洗整个小鼠，尤其是面部区域，然后将小鼠转移至解剖显微镜下操作。在层流罩中，小心解剖 WHI 垫片，避免切到毛囊球，将其置于室温下的汉克斯平衡盐溶液中。解剖 WHI 毛囊时，用镊子夹住毛囊旁边的皮肤，然后用直剪刀围绕毛囊进行切割，切割要深。为避免损伤毛囊，将胡须毛囊从胡须垫中轻轻提起并放入新的培养皿中。用新鲜的HBSS将同一培养皿中的毛囊冲洗干净。用锋利的镊子和针将一个毛囊固定在涂有丝绸保护层并含有HBSS的玻璃培养皿上。用缓冲液冲洗松散的脂肪组织和真皮组织，直至胡须毛囊清洁。如有必要，切断通向胡须毛囊的神经，并通过刮除及反复冲洗HBSS去除附着组织。使用微型刀片将胡须毛囊纵向切开。避免切得过深，以免损伤隆起部分。用HBSS反复冲洗，直至血液完全清除。血液的出现是切割深度已足够的良好指征。接下来，在毛乳头窦水平上方做一个横向切口，随后在分离的毛囊片段内，靠近皮肤的环状窦水平处做第二个横向切口。此时你将看到囊膜内部的隆起部分。看，就是这里。用镊子夹住胶囊的一端，移除膨大部分。此时您将看到空的胶囊以及分离出的膨大部分液池。将分离出的膨部分别置于室温下的HBSS中，在单独的培养皿中进行培养。确保没有其他组织污染混合的隆起组织。此时，隆起组织可在培养皿中进行培养。35毫米培养皿通过加入50微升胶原蛋白和10微升无菌液滴进行胶原包被。将6%盐水并排放置。用双弯移液管充分混匀，并将液体推至培养皿边缘，在洁净环境中孵育过夜，注意防止干燥。为此，我们使用底部放置有水盘的干燥器。第二天，即培养当天。用生理盐水冲洗培养板，然后将预先包被胶原并冲洗过的培养板用培养基在培养箱中预孵育约3小时。培养基由85% α修饰MEM、10%胎牛血清和5%第11天鸡胚提取物组成。预孵育后，从培养板中移除培养基，并加入尽可能少的培养基的多个BULs。去除多余的培养基。在细胞培养箱中，于含10%氧气和5%CO2的湿润环境中孵育一小时。一小时后，缓慢加入1.5毫升培养物。CHE培养的植块应贴附于胶原基质上，每天更换50%的培养基。好的，现在开始。现在观察培养物。在三到四天内，高迁移性的细胞将从球状聚集体中迁移出来。请注意这些细胞的星状形态以及细胞间接触的显著缺失。在接下来的几天内，将有更多细胞迁移出来，且已迁移出的细胞会迅速增殖，其中可能出现具有扁平形态的稀有细胞，这类细胞有时比表皮神经嵴细胞晚数天才显现。在这些培养物中有时可见干细胞，但这些细胞并非表皮神经嵴干细胞，而是运动能力较弱的、推测性的表皮干细胞或前体细胞。含有此类细胞的培养物应予以弃用。我们刚刚向您展示了如何制备含有表皮神经嵴干细胞的毛囊外根鞘培养物。由于神经嵴细胞具有很强的迁移性，它们会在3到4天内离开毛囊外根鞘。外植后，将毛囊外根鞘移除，纯化的神经嵴细胞群体则保留在培养板中。进行此操作时，重要的是要仔细对小鼠进行消毒，以避免污染。同时，在切割足垫时需切得足够深，以防损伤毛囊。在培养过程中，需注意区分迁移性的神经嵴细胞和非迁移性的鹅卵石状角质形成细胞。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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