Tre重组酶的分子进化

我叫Frank Alz。我是位于德累斯顿的马克斯·普朗克视网膜细胞生物学与遗传学研究所的课题组长。接下来，我将介绍我们关于开发位点特异性重组酶用于分子手术的研究工作。

基本上，作为一种能够从基因组中切除特定预设序列的工具，更具体地说，旨在清除被 HIV 感染的细胞中的病毒。也就是说，从感染细胞的基因组中切除 HIV 前病毒。另一个核心概念是，我们采用了已广泛确立的遗传学工具——即 Cre 重组酶，使其能够结合、识别并作用于我们预先设定的目标位点。

因此，我们着手研究是否能够设计一种位点特异性重组酶，使其能够结合HIV病毒LTR中天然存在的位点。如果我们能够实现这一目标，就可以预测，将有可能从基因组中切除前病毒。基本上，病毒的生命周期会经历一个阶段，即病毒整合到细胞中，随后通过逆转录过程生成一个DNA模板，该模板两侧由两个末端重复序列（LTR）所包围。

它们被称为长末端重复序列，或简称为短 LTR。随后，该结构进入细胞核，并或多或少随机地整合到宿主基因组中。此时便形成了所谓的前病毒，即已整合入基因组并由两个长末端重复序列（两个 LTR）所侧翼的病毒 DNA。

现在的设想是，如果我们能够制造出一种重组酶，使其识别存在于LTR中的序列，那么我们就有可能将前病毒以环状形式从宿主基因组中切除，从而彻底清除细胞中的病毒。这就是最初的概念。实际上，重组酶是一种DNA结合蛋白，它能够识别非常特异性的位点。

因此，它具有一个DNA结合域，能够识别DNA中的特定序列。只有当其识别到完全匹配的序列时，该酶才具有活性。对于其他任何序列，该酶均无活性。

分子进化的原理基本上是众所周知的，因为它本质上就是育种。因此，分子进化的一个原理是：引入突变，然后进行筛选过程，从中选出具有特定性状的个体。这与植物育种的过程是相同的。

你会希望获得特定的尺寸或特定的颜色，然后总是选择具有这些特征的下一代子代，并将它们相互交配繁殖。我们对分子所做的正是完全相同的过程，只不过基本上这一切都是在微观尺度上进行的。

因此，我们首先从一种具有特定活性的酶开始，在本例中为 CRE 重组酶，然后从一个野生型蛋白开始。接着，我们对该重组酶的结合位点进行轻微突变，但此时其活性仍然非常、非常、非常低。随后，我们在该酶即重组酶中引入随机突变，并筛选出能够结合该突变位点的突变体。

一旦获得这些突变体，我们就可以将不同的突变体组合在一起，最终得到我们期望的产物，使重组酶能够识别我们在LTR中定义的序列。因此，正如我所说，我们首先从一个随机突变文库开始，这通常是通过易错PCR来实现的。

因此，我们会使用一些PCR条件，例如使用容易出错的Taq聚合酶，从而产生大量错误。通过这种方法，我们能够构建一个在各处都带有随机突变的突变文库。我们还可以使用突变菌株，即细菌突变株，它可在特定转录本中引入大量突变。

然后将这些作为起始材料。我们使用的另一项技术是在一段时间后采用 DNA 改组。这基本上是一种允许你组合不同有益突变的技术，因为你并不确切知道哪些突变是有益的，但你会获得具有不同突变的各种突变体。

因此，你有一个基因在此处发生了有益的突变。你还有一个第二克隆，其在此处存在另一个突变。为了将这两个突变组合在一起，现在你需要对不同的DNA片段进行随机打断，然后通过PCR反应将这些片段重新组装。随后，在一定频率下，你会获得两者的组合产物，其中部分重组序列来自第一个突变体，另一部分来自第二个突变体。

然后，这个分子还将产生额外的效果，能够进一步提升筛选效率，使您能够更快地选出具有理想特性的候选分子。因此，我将设定一个定义：即野生型蛋白在某个特定位点上完全不具有活性。例如，如果我们从H-I-V-L-T-R的LTR中选取了一段序列，并用cre重组酶作用于该序列，则该酶在此序列上将完全不表现出任何活性。

CRE 重组酶无法对位点进行重组，而当你获得一种能够结合并重组该序列的酶时，按定义来说，你就拥有了一种新的重组酶。我们并未预先设定要进行多少轮循环，而是持续进行多轮实验，直到获得具有目标活性的酶为止。因此，我们最初从位点上的微小突变开始，然后逐步将不同的突变组合在一起。

这是该过程能够成功的关键步骤之一。因此，我们经历了多个中间阶段，并需经过如此多的循环才能获得一种具有足够活性、可进入下一循环的酶。这一过程与任何育种过程都非常相似。

你设定好希望获得的特定性状或特征，然后开始进行育种。只有当你获得了预期的结果才算成功，在此之前都需要继续进行更多世代的选育。这基本上就是其核心所在。

我还想说明一下，目前的120个进化循环，确切地说是128个循环，仅仅是为了找到一个中间步骤，即当我们观察到具有一定活性时就可以停止。但我们目前获得的重组酶活性仍然低于野生型CRE重组酶的活性。因此，为了获得活性更高的重组酶，我们还需要进行更多的进化循环。

因此，进化过程的基本终点并不在于我们目前所处的阶段。我并未发现存在任何技术上的限制，但这种方法究竟能推进到何种程度仍有待商榷。

因此，LTR侧的锁序列，即LTR HA中发现的序列，与天然的P侧锁序列（即发生重组所识别的天然侧序列）具有50%的序列相似性。那么问题在于，是否还能进一步优化？这一点我们目前尚不清楚，但事实上，我们所用的序列与野生型位点仅有50%的序列相似性，这表明还有进一步优化的空间。该重组酶在人类组织培养细胞中功能良好，尽管如我所说，其活性尚不及其对应重组酶在其对应位点上的活性。

因此，这种重组酶的稳定性可能略低于查询重组酶，即野生型酶的水平，未来需要进行更多的筛选和更多的进化循环，以改善这些特性。因此，第一步是我们改进该位点，即这种特异性的重组酶——三重组酶，使其活性更高，或许还能发现其他非常显著的位点，这些位点可作为LTR中的理想靶点，并为这些位点找到高效的重组酶。随后，我们需要在不同的实验体系中对该重组酶进行测试，首先是在组织培养细胞中，但更重要的是在动物模型中验证该重组酶的功能。

因此，我们需要检测这种重组酶在生物体内是否存在任何不良副作用。当然，另一个极具挑战性的问题是为此重组酶开发一种高效的递送系统，而这并非易事，其本身就是一个独立且庞大的研究领域。

这基本上是一种我们必须采用的基因治疗策略。我认为，我们正目睹医学逐渐向越来越分子化的方向转变。而要做到这一点，我们当然需要能够在如此微观的尺度上进行操作的工具。

这正是我所看到的进化过程的未来方向。因此，我们需要制造出能够作用于特定过程的定制酶。以重组酶为例，或许可以将其类比为外科医生在手术中需要使用的工具，用于切除某些必须移除的组织。在这里，我们需要的工具是，让分子层面的“外科医生”能够从基因组中特异性地切除某一段DNA序列。

为此，他需要具备能够实现这一目标的工具。而分子进化基本上可以实现这一功能。自然界中存在许多具有理想特性的酶，能够完成这一任务。

我们只需根据实际需求对它们进行改造，使其具备实用价值。我认为，分子进化在这一领域可以发挥非常重要的作用。目前尚难以明确界定其局限性，因为这项技术或这一领域仍处于发展初期。

因此，时间将会揭示这些局限性所在。我相信一定会存在某些局限性，但就目前而言，我认为机遇远多于真正的限制。