Name: TRE重组酶的分子进化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-29T12:12:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: 了解如何通过定向分子进化工程化Tre重组酶，使其特异性识别并切除HIV-1前病毒。该方法利用Cre重组酶作为起始模板，经过126轮进化循环获得具有19个氨基酸突变的新型酶，为基因治疗中的分子手术提供了概念验证。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者无任何利益冲突需要披露。

tre重组酶的分子进化

Molecular Evolution of the Tre Recombinase

本文报道了通过定向分子进化技术生成Tre重组酶的方法。Tre重组酶可识别HIV-1前病毒LTR序列中预先设定的目标序列，从而实现从前病毒感染的人类细胞中切除并彻底清除前病毒。
我们从Cre重组酶开始研究，这是一种分子量为38 kDa的重组酶，能够识别一段被称为loxP的34 bp双链DNA序列。由于Cre能够有效切除基因组中的特定序列，我们着手设计一种能够去除整合型HIV-1前病毒5'-LTR与3'-LTR之间序列的重组酶。第一步，我们鉴定了LTR位点中与loxP相似的序列，并检测其是否具有重组活性。最初，Cre及其突变型Cre文库均未能对所选的HIV-1前病毒loxLTR位点实现有效重组。由于任何定向分子进化过程的启动至少需要残余活性的存在，我们于是将原始的不对称loxLTR序列拆分为若干子集，并再次测试其重组活性。结果显示，这些子集可作为中间体，表现出一定的重组活性。随后，通过多轮迭代的进化循环对重组酶文库进行富集。接着，将富集后的文库进行洗牌（shuffling）和重新组合。不同突变之间的组合显示出协同效应，最终获得了能够重组loxLTR1和loxLTR2位点的重组酶。这一结果证明，通过中间体进行进化的策略是可行的。在总共经历了126轮进化循环后，我们对单个重组酶进行了功能和结构分析。其中活性最高的重组酶——Tre——相较于Cre含有19个氨基酸的改变。Tre重组酶能够从HIV-1感染的HeLa细胞基因组中切除HIV-1前病毒DNA（参见“利用进化获得的重组酶切除HIV-1前病毒DNA”，Hauber J.，德国汉堡 Heinrich-Pette 实验病毒学与免疫学研究所）。尽管该技术仍处于初级阶段，定向分子进化将有望催生定制化的酶类，作为“分子手术”和分子医学的有力工具。

本文报道了通过定向分子进化技术生成Tre重组酶的方法。Tre重组酶可识别HIV-1前病毒LTR序列中预先设定的目标序列，从而实现前病毒从感染的人类细胞中的切除与根除。尽管定向分子进化技术仍处于初期阶段，但它将有助于创建定制化的酶类，作为分子手术和分子医学的研究工具。

Tre重组酶的分子进化

本文报道了通过定向分子进化技术生成Tre重组酶的过程。Tre重组酶可识别特定的预定义靶序列，位于……

我叫Frank Alz。我是位于德累斯顿的马克斯·普朗克视网膜细胞生物学与遗传学研究所的课题组长。接下来，我将介绍我们关于开发位点特异性重组酶用于分子手术的研究工作。基本上，作为一种能够从基因组中切除特定预设序列的工具，更具体地说，旨在清除被 HIV 感染的细胞中的病毒。也就是说，从感染细胞的基因组中切除 HIV 前病毒。另一个核心概念是，我们采用了已广泛确立的遗传学工具——即 Cre 重组酶，使其能够结合、识别并作用于我们预先设定的目标位点。因此，我们着手研究是否能够设计一种位点特异性重组酶，使其能够结合HIV病毒LTR中天然存在的位点。如果我们能够实现这一目标，就可以预测，将有可能从基因组中切除前病毒。基本上，病毒的生命周期会经历一个阶段，即病毒整合到细胞中，随后通过逆转录过程生成一个DNA模板，该模板两侧由两个末端重复序列（LTR）所包围。它们被称为长末端重复序列，或简称为短 LTR。随后，该结构进入细胞核，并或多或少随机地整合到宿主基因组中。此时便形成了所谓的前病毒，即已整合入基因组并由两个长末端重复序列（两个 LTR）所侧翼的病毒 DNA。现在的设想是，如果我们能够制造出一种重组酶，使其识别存在于LTR中的序列，那么我们就有可能将前病毒以环状形式从宿主基因组中切除，从而彻底清除细胞中的病毒。这就是最初的概念。实际上，重组酶是一种DNA结合蛋白，它能够识别非常特异性的位点。因此，它具有一个DNA结合域，能够识别DNA中的特定序列。只有当其识别到完全匹配的序列时，该酶才具有活性。对于其他任何序列，该酶均无活性。分子进化的原理基本上是众所周知的，因为它本质上就是育种。因此，分子进化的一个原理是：引入突变，然后进行筛选过程，从中选出具有特定性状的个体。这与植物育种的过程是相同的。你会希望获得特定的尺寸或特定的颜色，然后总是选择具有这些特征的下一代子代，并将它们相互交配繁殖。我们对分子所做的正是完全相同的过程，只不过基本上这一切都是在微观尺度上进行的。因此，我们首先从一种具有特定活性的酶开始，在本例中为 CRE 重组酶，然后从一个野生型蛋白开始。接着，我们对该重组酶的结合位点进行轻微突变，但此时其活性仍然非常、非常、非常低。随后，我们在该酶即重组酶中引入随机突变，并筛选出能够结合该突变位点的突变体。一旦获得这些突变体，我们就可以将不同的突变体组合在一起，最终得到我们期望的产物，使重组酶能够识别我们在LTR中定义的序列。因此，正如我所说，我们首先从一个随机突变文库开始，这通常是通过易错PCR来实现的。因此，我们会使用一些PCR条件，例如使用容易出错的Taq聚合酶，从而产生大量错误。通过这种方法，我们能够构建一个在各处都带有随机突变的突变文库。我们还可以使用突变菌株，即细菌突变株，它可在特定转录本中引入大量突变。然后将这些作为起始材料。我们使用的另一项技术是在一段时间后采用 DNA 改组。这基本上是一种允许你组合不同有益突变的技术，因为你并不确切知道哪些突变是有益的，但你会获得具有不同突变的各种突变体。因此，你有一个基因在此处发生了有益的突变。你还有一个第二克隆，其在此处存在另一个突变。为了将这两个突变组合在一起，现在你需要对不同的DNA片段进行随机打断，然后通过PCR反应将这些片段重新组装。随后，在一定频率下，你会获得两者的组合产物，其中部分重组序列来自第一个突变体，另一部分来自第二个突变体。然后，这个分子还将产生额外的效果，能够进一步提升筛选效率，使您能够更快地选出具有理想特性的候选分子。因此，我将设定一个定义：即野生型蛋白在某个特定位点上完全不具有活性。例如，如果我们从H-I-V-L-T-R的LTR中选取了一段序列，并用cre重组酶作用于该序列，则该酶在此序列上将完全不表现出任何活性。CRE 重组酶无法对位点进行重组，而当你获得一种能够结合并重组该序列的酶时，按定义来说，你就拥有了一种新的重组酶。我们并未预先设定要进行多少轮循环，而是持续进行多轮实验，直到获得具有目标活性的酶为止。因此，我们最初从位点上的微小突变开始，然后逐步将不同的突变组合在一起。这是该过程能够成功的关键步骤之一。因此，我们经历了多个中间阶段，并需经过如此多的循环才能获得一种具有足够活性、可进入下一循环的酶。这一过程与任何育种过程都非常相似。你设定好希望获得的特定性状或特征，然后开始进行育种。只有当你获得了预期的结果才算成功，在此之前都需要继续进行更多世代的选育。这基本上就是其核心所在。我还想说明一下，目前的120个进化循环，确切地说是128个循环，仅仅是为了找到一个中间步骤，即当我们观察到具有一定活性时就可以停止。但我们目前获得的重组酶活性仍然低于野生型CRE重组酶的活性。因此，为了获得活性更高的重组酶，我们还需要进行更多的进化循环。因此，进化过程的基本终点并不在于我们目前所处的阶段。我并未发现存在任何技术上的限制，但这种方法究竟能推进到何种程度仍有待商榷。因此，LTR侧的锁序列，即LTR HA中发现的序列，与天然的P侧锁序列（即发生重组所识别的天然侧序列）具有50%的序列相似性。那么问题在于，是否还能进一步优化？这一点我们目前尚不清楚，但事实上，我们所用的序列与野生型位点仅有50%的序列相似性，这表明还有进一步优化的空间。该重组酶在人类组织培养细胞中功能良好，尽管如我所说，其活性尚不及其对应重组酶在其对应位点上的活性。因此，这种重组酶的稳定性可能略低于查询重组酶，即野生型酶的水平，未来需要进行更多的筛选和更多的进化循环，以改善这些特性。因此，第一步是我们改进该位点，即这种特异性的重组酶——三重组酶，使其活性更高，或许还能发现其他非常显著的位点，这些位点可作为LTR中的理想靶点，并为这些位点找到高效的重组酶。随后，我们需要在不同的实验体系中对该重组酶进行测试，首先是在组织培养细胞中，但更重要的是在动物模型中验证该重组酶的功能。因此，我们需要检测这种重组酶在生物体内是否存在任何不良副作用。当然，另一个极具挑战性的问题是为此重组酶开发一种高效的递送系统，而这并非易事，其本身就是一个独立且庞大的研究领域。这基本上是一种我们必须采用的基因治疗策略。我认为，我们正目睹医学逐渐向越来越分子化的方向转变。而要做到这一点，我们当然需要能够在如此微观的尺度上进行操作的工具。这正是我所看到的进化过程的未来方向。因此，我们需要制造出能够作用于特定过程的定制酶。以重组酶为例，或许可以将其类比为外科医生在手术中需要使用的工具，用于切除某些必须移除的组织。在这里，我们需要的工具是，让分子层面的“外科医生”能够从基因组中特异性地切除某一段DNA序列。为此，他需要具备能够实现这一目标的工具。而分子进化基本上可以实现这一功能。自然界中存在许多具有理想特性的酶，能够完成这一任务。我们只需根据实际需求对它们进行改造，使其具备实用价值。我认为，分子进化在这一领域可以发挥非常重要的作用。目前尚难以明确界定其局限性，因为这项技术或这一领域仍处于发展初期。因此，时间将会揭示这些局限性所在。我相信一定会存在某些局限性，但就目前而言，我认为机遇远多于真正的限制。

molecular-evolution-of-the-tre-recombinase

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

TRE重组酶的分子进化

目前的HIV-1治疗策略旨在抑制病毒生命周期，但无法有效根除感染。本文中，我们证明了一种经过基因工程改造的重组酶能够高效地从感染细胞的基因组中切除整合的HIV-1前病毒DNA。...

访谈：利用进化重组酶切除HIV-1前病毒DNA

同源重组技术通过实现分子水平上精确突变的构建，极大地推动了黑腹果蝇（Drosophila）遗传学的发展。近年来，重组工程（recombineering）技术的应用使得研究人员能够操作大片段DNA并将其转化到黑腹果蝇（Drosophila）中6。本文所介绍的方法结合了这些技术，可快速构建大型同源重组载体。...

在Drosophila中利用重组工程构建同源重组载体

酵母线粒体核样区蛋白 Mgm101 是一种 Rad52 型重组蛋白，能够形成大的寡聚环状结构。本文描述了一种利用麦芽糖结合蛋白（MBP）标签策略，结合阳离子交换层析和尺寸排阻层析来制备可溶性重组 Mgm101...

基于MBP标签策略制备Mgm101重组蛋白

本文介绍了一种同时定量T细胞受体切除环（TRECs）和κ删除重组切除环（KRECs）的方法。TREC/KREC检测可作为胸腺和骨髓输出功能的标志物。...

通过实时PCR同时定量T细胞受体切除环（TRECs）和κ删除重组切除环（KRECs）

可以从识别部分简并序列的酶出发，开发出具有新序列特异性的限制性内切酶。本文提供了我们成功用于改变NlaIV酶序列特异性的详细实验方案。该方案的关键要素包括转录/翻译反应的体外区室化，以及具有新序列特异性的变体筛选。...

体外定向进化具有更高特异性的限制性内切酶

位点特异性重组酶（SSR）技术及Cre/lox系统的出现推动了分子生物学的诸多进展，并已成为在转基因动物中评估基因功能的有力工具。本次访谈探讨了环化重组酶（Cre）介导的位点特异性重组机制，以及该酶的应用如何促进了条件性诱变技术的发展，相较于传统的基因敲除策略，条件性诱变具有显著优势。...

位点特异性重组酶（SSR）技术原理

我们介绍了评估捕食风险如何通过诱导食草动物改变饮食以满足 heightened stress...

关联捕食风险、植食动物生理应激与植物凋落物的微生物分解

我们在G蛋白偶联受体（GPCR）的不同特定位点处基因编码非天然氨基酸对叠氮-L-苯丙氨酸，并展示了叠氮基团在多种应用中的多功能性。这些应用包括一种靶向光交联技术，用于鉴定GPCR配体结合口袋中的残基，以及利用肽表位标签或荧光探针对GPCR进行位点特异性的生物正交修饰。...

基因编码的分子探针用于研究G蛋白偶联受体

本文提供了一种利用实时重组酶聚合酶扩增技术定量DNA样本初始浓度的实验方案，该方法可使用热循环仪或显微镜配合载物台加热器进行。同时介绍了内参阳性对照的构建方法。此外，提供了用于处理原始实时荧光数据的脚本。...

建立一种带有内参阳性对照的定量重组酶聚合酶扩增检测方法

轮虫是用作生态毒理学和衰老研究模型的微型浮游动物。本文提供了一种在Brachionus轮虫中进行高效且可重复的生存时间测定的实验方案。连续多代保持培养条件的一致性尤为重要，因为母体状况会影响子代的生命史特征。...

Brachionus 轮虫生存时间的测定：母体条件的同步化

了解如何通过定向分子进化工程化Tre重组酶，使其特异性识别并切除HIV-1前病毒。该方法利用Cre重组酶作为起始模板，经过126轮进化循环获得具有19个氨基酸突变的新型酶，为基因治疗中的分子手术提供了概念验证。

Tre重组酶的分子进化

探索更多视频