访谈：利用进化重组酶切除HIV-1前病毒DNA

我是 JohE Hvar，我将前往德国汉堡的 HE Pet 研究院细胞生物学与生物学系。HE PET 研究院是一所基础研究机构，专门专注于人类致病性病毒及其相关问题。我们部门主要致力于研究 HIV 基因表达的调控机制，以及 HIV 与宿主细胞组分之间，特别是细胞内相互作用。

基于这些数据，我们还致力于开发针对艾滋病（HIV疾病）的新型实验性疗法。HIV的问题在于，它是一种逆转录病毒或慢病毒，与其他所有逆转录病毒一样，在感染宿主细胞后，HIV会将其病毒基因组整合到宿主细胞的基因组中。迄今为止，人们仍无法彻底清除已整合的前病毒。

这意味着，在治疗方面，我们所讨论的是一种需要终身治疗的慢性疾病，基本上会伴随终身治疗所带来的各种问题，例如药物的副作用、耐药性的出现等等。多年来，在基础研究中，我们已经知道某些被称为重组酶的蛋白质，它们天然存在于酵母或细菌等生物的基因重组过程中。这些重组酶能够识别特定的DNA序列，实现基因的重排和基因组的重组等过程。

特别是有一种称为Cre重组酶的重组系统被广泛应用于基础研究中。Cre重组酶能够识别其特异性的序列，当两个识别位点之间存在一段序列时，Cre重组酶便可将这段中间的序列切除。

因此，这一理念早在10到15年前就已提出：一方面从医学角度彻底清除病毒，另一方面则利用如重组酶（例如Cre）等工具来切除前病毒DNA。理论上这是可行的，因为在感染过程中，HIV会将其RNA基因组通过逆转录转化为DNA，而在此逆转录过程中会产生称为长末端重复序列（long terminal repeats, LTR）的特定序列。这些序列基本上标记了整合前病毒DNA的5′端（起始端）和3′端（末端）。因此，理论上，如果能够设计出一种位点特异性重组酶，使其能特异性识别LTR中的特定序列，那么该重组酶便可作用于整合前病毒DNA的5′端和3′端，将中间的病毒DNA切除，从而彻底清除被感染细胞中的病毒。然而，HIV的问题在于，不同分离株之间存在差异，甚至在单个个体、单个患者体内也可能存在多种变异株。但目前已知的是，病毒基因组的起始和末端序列相对保守。

换句话说，LTR序列比HIV的基因更为保守。因此，我认为我们很有可能仅需少数几种重组酶，就能识别绝大多数HIV分离株。如果现有重组酶无法实现这一目标，则基本上需要通过分子进化手段生成新的重组酶，而这一过程在未来有望实现半自动化。

而且这个过程将比在实验室中操作快得多。我们的同事，来自马克斯·普朗克研究所的 Frank 博士，参与了这项研究。他基本上是重组酶及相关领域的专家。

基本上，他所使用的是我们称之为分子进化的方法。但该方法基于PCR（聚合酶链式反应）技术。他获取天然存在的重组酶基因（degree combs），并在能够随机引入突变的条件下，进行一轮或多轮PCR反应。

其关键在于筛选出已获得新功能或新活性的重组酶新版本，即能够识别HIV特异性序列的重组酶。他通过反复循环进行这一过程，大约进行了120次甚至超过120次循环，以实现这种分子进化方法。

当他最终获得这种特异性的、现在称为LTR特异性重组酶的新重组酶，该重组酶能够特异性识别HIV序列。本研究最初的实验是在汉堡的HE PET研究所进行的，我们特别将这种重组酶通过基因载体导入已感染了接近临床分离株的HIV-1的人类细胞培养物中。

随着时间的推移，在六到八周内，我们已能够证明这一点。现在，重组技术在定量上令人振奋，它们整合了HIV的剖面DA，基本上通过清除HIV使整个培养物得到治愈。然而，这项技术确实存在诸多问题。

首先，我们必须确保重组酶的表达不会引起毒性副作用。我们并不预期会出现此类问题，因为对于像 GRE 这样的天然发生的重组，已有所谓的转基因动物存在。这些动物表达这种 GRE 重组，虽然存在一些问题，但并不严重。

在此阶段我可以说，有望不会产生毒性副作用，但是否真正没有副作用，还需通过实验来验证。此外，还存在一些问题，例如我们可能无法用该方法识别出所有的临床分离株，从而难以清除患者体内占主导地位的HIV分离株。

但随着时间的推移，我们将从次要的、次要的分离株中进行选择。这一点我们尚不清楚，必须通过实验来验证。然后，在基因递送方面，在载体技术上存在一个重大问题。

我们必须使用所谓的慢病毒载体或逆转录病毒载体来递送基因或重组酶基因。那么，是否存在副作用？这些载体是否会引起毒性效应？

以上是我们的所有问题。此外，我们希望提高梳状结构的活性。目前，重组的发生速度比我们观察到的要快，我们观察到的活性是在几周的时间范围内。

因此，这些是我们未来几年必须深入研究的开放性问题。目前这确实是一个难题，因为重组酶无法通过口服途径给药。因此，不可能出现一种重组酶药片，只需服用就能彻底清除病毒。

因此，尽管是在推测未来的治疗方法，我们也必须考虑基因治疗策略。或许可以设想，从艾滋病病毒感染患者的血液中分离出所谓的造血干细胞或CD34阳性细胞，然后在实验室中将编码抗体的基因导入这些患者细胞中。

最后，我们将经过基因改造的患者细胞重新注入同一患者体内。理想情况下，随着时间的推移，患者的免疫系统或造血系统将至少部分地由这些改造后的细胞重建。当这些细胞感染HIV后，能够清除病毒，因为它们现在表达了重组酶。因此，预期效果是患者体内的病毒载量将下降，生活质量也将得到改善。

我们还可以希望，这些患者的免疫系统至少在部分程度上得到重建。因此，现在那些功能完全正常的免疫细胞有望能够攻击并清除患者体内残存的长期感染细胞。至于是否能够真正彻底地从患者体内根除 HIV，目前我们尚无法确定。