Name: 专访:HIV - 1前病毒DNA切除使用一个演进的重组酶 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-16T23:18:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: 了解利用工程化重组酶切除整合的HIV-1前病毒DNA的创新基因疗法。该方法通过分子进化技术靶向病毒长末端重复序列，为清除宿主细胞中的病毒储存库提供了潜在的治愈策略。

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请查看相关视频《&nbsp;<a href="https://www.jove.com/index/details.stp?ID=718" target="_blank">位点特异性重组酶（SSR）技术原理</a>&nbsp;》和《<a href="https://www.jove.com/index/details.stp?ID=791" target="_blank">Tre 重组酶的分子进化</a>》，以了解更多关于位点特异性重组及重组酶酶特异性位点工程化的信息。

作者无任何利益冲突需要披露。

访谈：利用进化重组酶切除hiv-1前病毒dna

Interview: HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase

HIV-1 会整合到被感染细胞的宿主染色体中，并以两侧被长末端重复序列（long terminal repeats）包围的前病毒形式持续存在。目前的治疗策略主要靶向病毒酶或病毒与细胞的融合过程，虽可抑制病毒生命周期，但无法根除感染。由于这些方法并不作用于已整合的前病毒，因此可能产生新的耐药性 HIV-1 毒株。本文报道了经基因工程改造的重组酶 Tre（参见 Buchholz F.，德国德累斯顿马克斯·普朗克细胞生物学与遗传学研究所的《Tre 重组酶的分子进化》）能够高效地从感染细胞的基因组中切除整合的 HIV-1 前病毒 DNA。我们构建了含有 loxLTR 的病毒假型，并用于感染 HeLa 细胞，以检测 Tre 重组酶是否能够从 HIV-1 感染的人类细胞基因组中切除前病毒。通过克隆获得可释放病毒颗粒的细胞系，并转染表达 Tre 的质粒或亲本对照载体。随后监测重组酶活性及病毒产生情况。所有实验均证实，该重组酶可高效地从感染细胞中删除前病毒，且未观察到明显的细胞毒性效应。这些结果证明了可通过进化手段获得能够特异性靶向 HIV-1 LTR 的重组酶，且该重组酶具备从 HIV-1 感染的人类细胞基因组中切除 HIV-1 前病毒的能力。
然而，在工程化重组酶进入治疗领域之前，仍需克服诸多重大障碍。其中我们面临的关键问题包括：向靶细胞高效且安全地递送，以及避免产生副作用。

目前的HIV-1治疗策略旨在抑制病毒生命周期，但无法有效根除感染。本文中，我们证明了一种经过基因工程改造的重组酶能够高效地从感染细胞的基因组中切除整合的HIV-1前病毒DNA。

访谈：利用进化重组酶切除HIV-1前病毒DNA

HIV-1 会整合到感染细胞的宿主染色体中，并以长末端重复序列（long terminal repeats）为侧翼，以原病毒形式持续存在。目前的治疗策略……

我是 JohE Hvar，我将前往德国汉堡的 HE Pet 研究院细胞生物学与生物学系。HE PET 研究院是一所基础研究机构，专门专注于人类致病性病毒及其相关问题。我们部门主要致力于研究 HIV 基因表达的调控机制，以及 HIV 与宿主细胞组分之间，特别是细胞内相互作用。基于这些数据，我们还致力于开发针对艾滋病（HIV疾病）的新型实验性疗法。HIV的问题在于，它是一种逆转录病毒或慢病毒，与其他所有逆转录病毒一样，在感染宿主细胞后，HIV会将其病毒基因组整合到宿主细胞的基因组中。迄今为止，人们仍无法彻底清除已整合的前病毒。这意味着，在治疗方面，我们所讨论的是一种需要终身治疗的慢性疾病，基本上会伴随终身治疗所带来的各种问题，例如药物的副作用、耐药性的出现等等。多年来，在基础研究中，我们已经知道某些被称为重组酶的蛋白质，它们天然存在于酵母或细菌等生物的基因重组过程中。这些重组酶能够识别特定的DNA序列，实现基因的重排和基因组的重组等过程。特别是有一种称为Cre重组酶的重组系统被广泛应用于基础研究中。Cre重组酶能够识别其特异性的序列，当两个识别位点之间存在一段序列时，Cre重组酶便可将这段中间的序列切除。因此，这一理念早在10到15年前就已提出：一方面从医学角度彻底清除病毒，另一方面则利用如重组酶（例如Cre）等工具来切除前病毒DNA。理论上这是可行的，因为在感染过程中，HIV会将其RNA基因组通过逆转录转化为DNA，而在此逆转录过程中会产生称为长末端重复序列（long terminal repeats, LTR）的特定序列。这些序列基本上标记了整合前病毒DNA的5′端（起始端）和3′端（末端）。因此，理论上，如果能够设计出一种位点特异性重组酶，使其能特异性识别LTR中的特定序列，那么该重组酶便可作用于整合前病毒DNA的5′端和3′端，将中间的病毒DNA切除，从而彻底清除被感染细胞中的病毒。然而，HIV的问题在于，不同分离株之间存在差异，甚至在单个个体、单个患者体内也可能存在多种变异株。但目前已知的是，病毒基因组的起始和末端序列相对保守。换句话说，LTR序列比HIV的基因更为保守。因此，我认为我们很有可能仅需少数几种重组酶，就能识别绝大多数HIV分离株。如果现有重组酶无法实现这一目标，则基本上需要通过分子进化手段生成新的重组酶，而这一过程在未来有望实现半自动化。而且这个过程将比在实验室中操作快得多。我们的同事，来自马克斯·普朗克研究所的 Frank 博士，参与了这项研究。他基本上是重组酶及相关领域的专家。基本上，他所使用的是我们称之为分子进化的方法。但该方法基于PCR（聚合酶链式反应）技术。他获取天然存在的重组酶基因（degree combs），并在能够随机引入突变的条件下，进行一轮或多轮PCR反应。其关键在于筛选出已获得新功能或新活性的重组酶新版本，即能够识别HIV特异性序列的重组酶。他通过反复循环进行这一过程，大约进行了120次甚至超过120次循环，以实现这种分子进化方法。当他最终获得这种特异性的、现在称为LTR特异性重组酶的新重组酶，该重组酶能够特异性识别HIV序列。本研究最初的实验是在汉堡的HE PET研究所进行的，我们特别将这种重组酶通过基因载体导入已感染了接近临床分离株的HIV-1的人类细胞培养物中。随着时间的推移，在六到八周内，我们已能够证明这一点。现在，重组技术在定量上令人振奋，它们整合了HIV的剖面DA，基本上通过清除HIV使整个培养物得到治愈。然而，这项技术确实存在诸多问题。首先，我们必须确保重组酶的表达不会引起毒性副作用。我们并不预期会出现此类问题，因为对于像 GRE 这样的天然发生的重组，已有所谓的转基因动物存在。这些动物表达这种 GRE 重组，虽然存在一些问题，但并不严重。在此阶段我可以说，有望不会产生毒性副作用，但是否真正没有副作用，还需通过实验来验证。此外，还存在一些问题，例如我们可能无法用该方法识别出所有的临床分离株，从而难以清除患者体内占主导地位的HIV分离株。但随着时间的推移，我们将从次要的、次要的分离株中进行选择。这一点我们尚不清楚，必须通过实验来验证。然后，在基因递送方面，在载体技术上存在一个重大问题。我们必须使用所谓的慢病毒载体或逆转录病毒载体来递送基因或重组酶基因。那么，是否存在副作用？这些载体是否会引起毒性效应？以上是我们的所有问题。此外，我们希望提高梳状结构的活性。目前，重组的发生速度比我们观察到的要快，我们观察到的活性是在几周的时间范围内。因此，这些是我们未来几年必须深入研究的开放性问题。目前这确实是一个难题，因为重组酶无法通过口服途径给药。因此，不可能出现一种重组酶药片，只需服用就能彻底清除病毒。因此，尽管是在推测未来的治疗方法，我们也必须考虑基因治疗策略。或许可以设想，从艾滋病病毒感染患者的血液中分离出所谓的造血干细胞或CD34阳性细胞，然后在实验室中将编码抗体的基因导入这些患者细胞中。最后，我们将经过基因改造的患者细胞重新注入同一患者体内。理想情况下，随着时间的推移，患者的免疫系统或造血系统将至少部分地由这些改造后的细胞重建。当这些细胞感染HIV后，能够清除病毒，因为它们现在表达了重组酶。因此，预期效果是患者体内的病毒载量将下降，生活质量也将得到改善。我们还可以希望，这些患者的免疫系统至少在部分程度上得到重建。因此，现在那些功能完全正常的免疫细胞有望能够攻击并清除患者体内残存的长期感染细胞。至于是否能够真正彻底地从患者体内根除 HIV，目前我们尚无法确定。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

专访:HIV - 1前病毒DNA切除使用一个演进的重组酶

本文报道了通过定向分子进化技术生成Tre重组酶的方法。Tre重组酶可识别HIV-1前病毒LTR序列中预先设定的目标序列，从而实现前病毒从感染的人类细胞中的切除与根除。尽管定向分子进化技术仍处于初期阶段，但它将有助于创建定制化的酶类，作为分子手术和分子医学的研究工具。...

Tre重组酶的分子进化

来源： Tang, N., et al. 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建重组禽疱疹病毒载体. J. Vis. Exp.

克隆分离及PCR筛选保留靶基因的GFP切除型重组疱疹病毒

来源：Manocheewa, S., 等. 用于确定人类免疫缺陷病毒复制适合度的成对生长竞争实验。 J. Vis. Exp.

一种用于测量病毒株相对复制适合度的检测方法

近等基因病毒之间的生长竞争可为确定相对复制适合度提供一种灵敏的测量方法。本文所述方案包括重组HIV-1克隆的构建、病毒扩增以及优化的生长竞争实验与分析方法，以获得灵敏且一致的结果。...

测定人类免疫缺陷病毒复制适合度的成对生长竞争实验

我们描述了一种从感染细胞的基因组DNA中扩增逆转录病毒整合位点、对扩增的病毒-宿主连接区域进行测序，并将这些序列比对至参考基因组的实验方案。此外，我们还介绍了利用BEDTools量化整合位点在不同基因组注释区域相对分布的技术。...

逆转录病毒整合位点的扩增、下一代测序与基因组DNA定位

本文描述了一种双向整合位点检测方法的实验流程及软件分析步骤，该方法可同时分析上游和下游的载体-宿主连接DNA。所获得的双向PCR产物可用于任何下游测序平台。所得数据可用于对整合的DNA靶标进行高通量、定量的比较分析。...

双向逆转录病毒整合位点PCR方法及定量数据分析流程

全长单个前病毒测序（FLIPS）是一种高效、高通量的方法，可用于扩增和测序单个接近全长的（完整和有缺陷的）HIV-1前病毒，并可评估其潜在的复制能力。FLIPS克服了以往用于测序潜伏HIV-1储存库的检测方法的局限性。...

用于下一代测序的近全长HIV-1前病毒扩增

我们介绍一种基因组工程工作流程，用于构建可模拟前病毒在特定基因组位点整合的新一代体外HIV-1感染模型。通过CRISPR-Cas9介导的位点特异性基因组编辑，可实现对HIV来源报告基因的靶向整合。本文提供了单细胞克隆生成、筛选及正确靶向验证的详细实验方案。...

基于CRISPR-Cas9的基因组工程构建整合位点特异的HIV-1感染Jurkat报告模型

本文介绍一种深度测序方法，可无偏倚地确定新生3'末端以及单链DNA分子的突变谱型。该方法的主要应用是表征新生逆转录病毒互补DNA（cDNA），即逆转录病毒逆转录过程中产生的中间产物。...

确定感染细胞中HIV-1逆转录过程中新生单链病毒DNA的3'-末端及其序列

本文描述并应用了一种高通量方案，用于功能性评估高效激活HIV并清除潜伏前病毒的效果，通过检测干预措施对HIV转录和剪接的影响来实现。文中提供了潜伏期逆转剂对LTR驱动的转录和剪接作用的代表性结果。...

高通量体外评估潜伏逆转剂对HIV转录与剪接的影响

本方案描述了一种通过结合使用易错PCR合成全长突变RNA和反向遗传学技术，在丙型肝炎病毒基因组中引入可控遗传多样性的方法。该方法提供了一个表型筛选模型，可用于长达10...

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了解利用工程化重组酶切除整合的HIV-1前病毒DNA的创新基因疗法。该方法通过分子进化技术靶向病毒长末端重复序列，为清除宿主细胞中的病毒储存库提供了潜在的治愈策略。

访谈：利用进化重组酶切除HIV-1前病毒DNA

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