Name: 在体外分化的小鼠胚胎干细胞（MES）使用悬滴法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-23T22:33:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: 了解悬滴法体外分化小鼠胚胎干细胞形成类胚体的完整流程。该方法通过悬浮培养促进细胞聚集，为再生医学和细胞治疗研究提供可靠的实验技术。

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<ol>
<li>使用 0.1% 明胶溶液对 T75 培养瓶进行明胶化处理，并于前一天晚上将其置于 37°C、5% CO2 的组织培养箱中过夜孵育。</li>
<li>从培养箱中取出 mES 细胞，吸除培养基，用 PBS 清洗 ES 细胞培养物，加入 0.05% 胰蛋白酶溶液覆盖培养皿底部（2 ml/100 mm 培养皿）。</li>
<li>在 37°C 下孵育约 1 分钟，直至细胞开始从培养皿上脱落。 </li>
<li>用带棉塞的巴斯德移液管轻轻吹打胰酶消化后的细胞 4 至 6 次，以分散 ES 细胞。将分散后的 ES 细胞转移至含有&nbsp;预热（37°C）mES 培养基的 15 ml 圆锥形离心管中。 </li>
<li>通过离心收集细胞，吸除上清液，加入 10 ml mES 培养基，并上下吹打形成单细胞悬液。 </li>
<li>将细胞悬液转移至预先用 0.1% 明胶包被的 T75 培养瓶中，在 37°C、5% CO2 条件下孵育 1 小时&nbsp; *1 小时后，成纤维细胞已贴附于培养瓶表面，而干细胞仍悬浮于培养基中。用移液器吸取培养基以收集干细胞。 </li>
<li>以 1000 rpm 离心 5 分钟，吸除 mES 培养基。然后加入 10 ml mES 分化培养基，反复吹打重悬细胞，直至形成均匀的细小细胞悬液。</li>
<li>使用血细胞计数板计数细胞，并用分化培养基将干细胞悬液稀释至每 20 µl 含 400 至 500 个细胞的浓度（20 µl/滴），在无菌培养皿中进行操作。&nbsp; </li>
<li>打开培养皿盖，小心将其倒置并放置在含有 10 ml PBS 的培养皿上方。&nbsp;使用多通道移液器，在组织培养皿盖内侧倒置的表面上逐行滴加 20 µl 的液滴。</li>
<li>小心将培养皿放入培养箱中孵育 2 天。两天后，小心翻转培养皿盖，吸除 180 µl 新鲜分化培养基，并将数滴细胞悬液转移至 96 孔超低吸附培养板的孔中。然后用移液器逐个拾取液滴并转移至 96 孔板中。将培养板放入培养箱中静置培养 3 天。 </li>
<li>用 300 µl 0.1% 明胶溶液包被 48 孔组织培养板的每个孔。加入明胶后，于前一天晚上在 37°C 下过夜孵育，以备后续接种胚状体（EBs）。</li>
<li>次日，吸除 48 孔板中的明胶溶液，然后向每孔加入 300 µl 分化培养基。将 96 孔板中的胚状体（EBs）逐个转移至 48 孔明胶包被的培养板中。次日更换培养基，之后每隔一天更换一次培养基以维持细胞生长。 </li>
<li>自发性心肌细胞收缩应在 7 天内明显可见。</li>
</ol>

<ol><li>Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+mouse+embryonic+stem+cells+are+able+to+differentiate+into+cardiomyocytes+expressing+chronotropic+responses+to+adrenergic+and+cholinergic+agents+and+Ca2%2B+channel+blockers%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers.</a> Differentiation. 48, 173-182 (1991).</li>
<li>Metzger, J. M., Lin, W. I., Samuelson, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+in+cardiac+contractile+sensitivity+to+calcium+during+the+in+vitro+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> J Cell Biol. 126, (1994).</li>
</ol>

悬滴法的缺点如下：由于需要依靠表面张力使液滴悬挂在盖子上，液滴体积受限，通常小于50 µL；此外，无法对悬滴中的培养基进行更换。在培养过程中，直接通过显微镜观察液滴中拟胚体（EBs）的形成也非常困难。此外，悬滴法包含两个步骤，因此该方法的一系列操作可能较为繁琐。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>试剂</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>试剂</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>试剂</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>试剂</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>试剂</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>试剂</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>11360-70</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;巯基&amp;#8211;乙醇</td><td>试剂</td><td>Chemicon International</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>白血病抑制因子（LIF）</td><td>试剂</td><td>Chemicon International</td><td>LIF2005</td><td></td></tr><tr><td>96孔超低吸附板</td><td>工具</td><td>Corning</td><td>3474</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠胚胎干细胞（mes细胞）体外悬滴法分化

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

干细胞具有分化为多种不同类型细胞的显著潜力。当干细胞分裂时，每个新细胞都有可能保持干细胞特性，或转变为具有更特化功能的其他类型细胞。这一科学前景正促使研究人员探索基于细胞的疾病治疗策略。

在缺乏抗分化因子的悬浮培养条件下，胚胎干细胞会自发分化并形成三维多细胞聚集体，这些细胞聚集体被称为拟胚体（embryoid bodies, EB）。悬滴培养法是一种广泛使用的诱导EB形成的方法。悬滴的圆底结构有利于胚胎干细胞的聚集，可为小鼠胚胎干细胞（mES细胞）提供利于EB形成的良好环境。通过调整初始细胞悬液中细胞的数量，进而控制从培养皿盖上悬挂成滴的细胞数目，即可调控悬滴中聚集的胚胎干细胞数量。利用该方法，我们能够以预定数量的胚胎干细胞可重复地生成均一的拟胚体。

关键词：干细胞，胚胎干细胞，拟胚体，EB，悬滴培养，细胞分化，细胞聚集，mES细胞

本视频演示了如何利用悬滴法在体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为类胚体。

小鼠胚胎干细胞（mES细胞）体外悬滴法分化

干细胞具有分化为多种不同类型细胞的显著潜能。当一个干细胞分裂时，每个新细胞都有可能……

干细胞具有分化为体内多种不同类型细胞的显著潜能。它们作为机体的一种修复系统，理论上能够无限分裂，以更新其他细胞。当干细胞分裂时，每个新细胞都有可能保持为干细胞，或转变为具有更特化功能的其他类型细胞。这一充满前景的科学领域正促使科学家探索基于细胞的体外疾病治疗方法。当允许胚胎干细胞在悬浮培养中聚集时，便会启动其分化过程。在无小鼠胚胎成纤维细胞饲养层和白血病抑制因子的情况下，这些细胞聚集体被称为胚状体。悬滴法是一种在体外将干细胞分化为胚状体的有效方法。大家好，我是来自斯坦福大学心血管医学部左翼实验室的 Sha Juan。今天，我们将向您展示一种利用悬滴法使胚胎干细胞定向分化为拟胚体的实验操作流程。我们通常采用该方法将胚胎干细胞分化为心肌细胞。本实验流程包括以下步骤：制备胚胎干细胞的单细胞悬液、形成悬滴培养物、将悬滴培养物转移至超低吸附培养板，以及将拟胚体接种至明胶包被的培养板上。好的，让我们开始。该实验步骤的第一步是制备胚胎干细胞的单细胞悬液。由于我们通常将未分化的胚胎干细胞培养在小鼠胚胎成纤维细胞上，因此必须将细胞解离并从成纤维细胞中分离出来。为此，我们采用标准操作对细胞进行胰蛋白酶消化。胰蛋白酶处理完成后，加入小鼠胚胎干细胞培养基以中和胰蛋白酶活性。随后，将细胞悬液转移至15 mL锥形管中。然后用移液器反复吹打管底，使细胞团块分散，直至获得均匀的单细胞悬液，无可见细胞团块。随后以1000转/分钟离心5分钟。离心后吸除上清液，并用10 mL小鼠ES细胞培养基重新悬浮细胞。将细胞悬液转移至预先用0.1%明胶包被的T75培养瓶中，在37摄氏度、5%CO2条件下孵育1小时。1小时后，成纤维细胞已贴壁，而干细胞仍悬浮于培养基中。用移液器吸出培养基以收集干细胞。以1000转/分钟的速度离心细胞5分钟，吸去培养基。然后加入10 mL分化培养基，通过反复吹打重悬细胞，直至形成均匀的单细胞悬液。使用血细胞计数板对细胞进行计数。现在我们已准备好使用悬滴法培养细胞悬液。开始悬滴培养时，用分化培养基将干细胞悬液稀释至每20微升含500个细胞的浓度。接下来，将一个150毫米组织培养皿的皿盖翻转过来。然后将20微升细胞悬液移取到培养皿盖的内表面。使用多通道移液器，向培养皿中加入10毫升PBS。迅速将培养皿盖翻转，并轻轻放置在培养皿上，以形成悬滴。将培养板盖盖好后，小心地将培养板转移至培养箱中进行培养。细胞静置培养两天。待培养完成后，我们将进行下一步操作，即将悬滴培养物转移至超低吸附培养板中。两天后，小心翻转培养板盖子，随后吸出180微升新鲜分化培养基，并将数滴加入至96孔超低吸附培养板中。然后用移液器吸取液滴，逐个转移至96孔板中。将培养板放入培养箱中，静置培养三天。胚胎体将继续生长成球形。当孵育完成后，我们将准备对胚胎体进行铺板，以促进胚胎体进一步分化。我们将它们转移至一个48孔明胶包被的培养板中。操作时，我们首先在每孔中加入300微升0.1%明胶进行包被。加入明胶后，将培养板在37摄氏度下孵育过夜。第二天，吸去48孔板中的明胶。然后每孔加入300微升分化培养基。现在逐个将胚胎体从96孔板转移至已包被明胶的48孔板中。我们通常在次日更换培养基，之后每隔一天更换一次，以维持细胞生长。我们采用这种方法探索更优的胚胎干细胞分化方案。在心肌细胞实验中，我们已向您展示了如何利用悬滴培养法进行小鼠胚胎干细胞的体外分化。该方法之所以有效，是因为悬滴的圆形底部有利于胚胎干细胞聚集，从而为胚胎体的形成提供了良好的环境。进行此操作时，需要注意悬滴中聚集的胚胎干细胞数量可通过调整初始细胞悬液中的细胞数量来控制。就是这样。感谢观看。祝您的实验顺利。

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在体外分化的小鼠胚胎干细胞（MES）使用悬滴法

本方案详细描述了从小鼠胚胎干细胞（ESC）中获得可移植的造血干细胞，并将其注射到致死剂量辐照的受体小鼠中的过程。简言之，ESC 被诱导形成拟胚体并进行分化，随后用逆转录病毒 HoxB4 感染，并与 OP9...

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小鼠胚胎干细胞高效分化为运动神经元

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本视频演示了一种方法 体外 从小鼠胚胎干细胞（mESCs）生成神经前体细胞（NPCs）。将mESCs在悬浮培养中形成拟胚体（EBs），随后诱导其分化为NPCs 通过...

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本文建立了一种低成本且易于操作的方法，可实现胚胎干细胞向神经元的快速高效分化。该方法适用于在各实验室中推广应用，可为神经科学研究提供有力工具。...

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小鼠胚胎干细胞向神经前体细胞及神经元的分化与鉴定

了解悬滴法体外分化小鼠胚胎干细胞形成类胚体的完整流程。该方法通过悬浮培养促进细胞聚集，为再生医学和细胞治疗研究提供可靠的实验技术。

小鼠胚胎干细胞（mES细胞）体外悬滴法分化

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