Name: 在人类胚胎干细胞体外培养的标签用于磁共振成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-03T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: 了解如何使用氯化锰标记人类胚胎干细胞进行磁共振成像。该方法通过电压门控钙通道进入活细胞，提供正信号，优于氧化铁标记，可精确追踪移植干细胞的存活状态。

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人胚胎干细胞的锰标记
<ol>
<li>将已在无饲养层条件下培养的人胚胎干细胞进行胰蛋白酶消化5分钟。加入培养基中和胰蛋白酶。</li>
<li>在20°C下以800 rpm离心5分钟使细胞沉淀。重新悬浮细胞沉淀后，通过台盼蓝染色计数细胞数量。根据所获得的细胞计数结果，将细胞均分为四份，每份300万个细胞，分装至锥形管中。再次通过离心使细胞沉淀。</li>
<li>在即将开始锰标记前，用0.9%氯化钠溶液溶解新鲜的氯化锰，配制0.1 mM的氯化锰溶液。</li>
<li>为观察钙通道活性，准备了四个样品。第一个样品为对照组，仅含在0.9%氯化钠溶液中孵育的细胞；第二个样品含在0.1 mM MnCl2中孵育的细胞；第三和第四个样品则分别含在0.1 mM MnCl2中孵育的细胞，并额外加入5 μM的Ca2+通道激动剂(s)-(-)-Bay K8644或250 μM的Ca2+通道拮抗剂维拉帕米。将四个样品在37°C、5% CO2条件下孵育30分钟。</li>
<li>30分钟后，在20°C下以800 rpm离心5分钟使细胞沉淀，吸除上清液，并用PBS洗涤标记后的细胞两次。洗涤后，将每份细胞沉淀重新悬浮于200 μL PBS中，转移至PCR管中。这些细胞沉淀通常呈白色。</li>
</ol>
人胚胎干细胞的铁标记
<ol>
<li>将临床级硫酸鱼精蛋白与蒸馏水混合，配制成 1 mg/mL 的储存液。</li>
<li>在含有人胚胎干细胞培养基的离心管中，加入终浓度为 100 μg/mL 的超顺磁性氧化铁颗粒（ferumoxides），随后加入 12 μg/mL 的硫酸鱼精蛋白。剧烈混匀溶液 5 分钟。</li>
<li>将上述混合溶液加入等体积的细胞培养基中，使终浓度为 50 μg/mL 的ferumoxides和 6 μg/mL 的硫酸鱼精蛋白，用于细胞标记。将细胞在此溶液中孵育 12 小时。</li>
<li>用 PBS 洗涤细胞两次，最后一次洗涤液中加入 10 U/mL 肝素，以溶解细胞外的ferumoxides-硫酸鱼精蛋白复合物。洗涤后，用胰蛋白酶消化细胞，获得单细胞悬液。</li>
<li>计数细胞，并分装为所需数量的样品。洗涤后，将每份细胞沉淀重悬于 200 μL PBS 中，转移至 PCR 管。这些细胞沉淀应呈深橙褐色。</li>
</ol>
进行细胞磁共振成像
<ol>
<li>制备一个模体，用于固定含有细胞沉淀的试管，并在扫描过程中避免周围空气造成的伪影。具体方法为：将0.8%的琼脂和1%的硫酸铜溶于蒸馏水中，通过微波加热5–7分钟至沸腾。将该混合物冷却至少1小时，使其形成凝胶后用于扫描。</li>
<li>将含有标记细胞沉淀的试管放入模体中进行扫描。体外细胞磁共振成像在Signa HDx 3T MRI（GE Medical Systems）仪器上使用临床膝关节线圈完成。</li>
<li>对三个样本中的锰标记细胞采用自旋回波序列进行扫描：TR（重复时间）= 800毫秒；TE（回波时间）= 最小值；FOV（视野）= 12 × 12 cm；矩阵 = 256×256；NEX = 1。</li>
<li>对铁标记细胞采用梯度回波序列进行扫描。成像参数如下：TR = 100毫秒；TE = 10毫秒；FA（翻转角）= 30°；FOV = 12 × 12 cm；矩阵 = 256 × 256；NEX = 1。</li>
</ol>
分析 MRI 结果
<ol>
<li>分析4个不同样本的锰标记细胞MRI扫描图像： 
<ul>
<li>样本#1为对照组，含有仅在0.9%氯化钠溶液中孵育的细胞。</li>
<li>样品 #2 含有在 0.1 mM MnCl 中孵育的细胞2. </li>
<li>样品 #3 包含在 0.1 mM MnCl 中孵育的细胞2 使用5 μM的Ca2+-通道激动剂，(S)-(-)-Bay K8644</li>
<li>样品 #4 包含在 0.1 mM MnCl 中孵育的细胞2 使用 250 μM 的 Ca2+-通道拮抗剂，维拉帕米。 </li>
</ul>
</li>
<li>正如所预测的，锰标记细胞的信号强度差异可见。与仅用锰标记的细胞相比，在钙通道激动剂存在时信号强度明显增强，而在钙通道拮抗剂存在时信号强度降低。使用Image J软件（NIH, Bethesda, MD, USA）测量锰标记细胞信号强度增加的区域。同一软件也用于分析铁标记细胞产生的暗区离共振信号的面积。铁标记细胞产生的暗信号区域大小取决于细胞数量或细胞内含铁颗粒的数量。在此情况下，一百万个细胞所产生的暗信号区域小于来自&nbsp;三百万个细胞</li>
</ol>

<ol><li>Bruvold, M., Nordhoy, W., Anthonsen, H. W., Brurok, H., Jynge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manganese-calcium+interactions+with+contrast+media+for+cardiac+magnetic+resonance+imaging%3A+a+study+of+manganese+chloride+supplemented+with+calcium+gluconate+in+isolated+Guinea+pig+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Radiol%22%5BJournal%5D)">Manganese-calcium interactions with contrast media for cardiac magnetic resonance imaging: a study of manganese chloride supplemented with calcium gluconate in isolated Guinea pig hearts.</a> Invest Radiol. 40, 117-125 (2005).</li>
<li>Aoki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+labeling+for+magnetic+resonance+imaging+with+the+T1+agent+manganese+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">Cell labeling for magnetic resonance imaging with the T1 agent manganese chloride.</a> NMR Biomed. 19, 50-59 (2006).</li>
<li>Arbab, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+magnetic+cell+labeling+with+protamine+sulfate+complexed+to+ferumoxides+for+cellular+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI.</a> Blood. 104, 1217-1223 (2004).</li>
<li>Arbab, A. S., Frank, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+MRI+and+its+role+in+stem+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Cellular MRI and its role in stem cell therapy.</a> Regen Med. 3, 199-215 (2008).</li>
</ol>

这些结果表明，锰可通过电压门控钙通道进入细胞，且锰可用作磁共振成像（MRI）对比剂，同时反映细胞活力。因此，我们建议，锰增强磁共振成像可用于监测人胚胎干细胞移植至心肌后细胞的存活情况。

<table><tbody><tr><td>四水合氯化锰</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8054</td><td></td></tr><tr><td>(S)-(-)-Bay K8644</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B133</td><td></td></tr><tr><td>(+)-盐酸维拉帕米，滴定纯度不低于99.0%</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠 0.85-0.90% W/V</td><td>试剂</td><td>VWR international</td><td>VW 3257-1</td><td></td></tr><tr><td>Feridex I.V.</td><td>试剂</td><td>Berlex Laboratories</td><td>NDC 59338-7035-5</td><td>含铁11.2mg/mL的葡聚糖铁注射液</td></tr><tr><td>硫酸鱼精蛋白</td><td>试剂</td><td>American Pharmaceutical Partners</td><td>NDC 63323-229-05</td><td>50 mg (10 mg/mL)</td></tr><tr><td>Knockout SR（胚胎干细胞用血清替代物）</td><td>试剂</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>试剂</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基&amp;#8211;乙醇 98+%</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M 3148</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 200 mM 100倍浓缩液</td><td>试剂</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素 10,000 单位/mL</td><td>试剂</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸 100倍浓缩液</td><td>试剂</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Signa HDx 3T MRI</td><td>工具</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>临床膝关节线圈</td><td>工具</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>试剂</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr></tbody></table>

体外标记人胚胎干细胞用于磁共振成像

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

人类胚胎干细胞（hESC）已显示出修复受损心肌的能力。磁共振成像（MRI）已成为评估受损心肌修复情况的主要成像手段之一。此外，体外标记剂（如氧化铁纳米颗粒）已被用于追踪和定位移植的干细胞。然而，该方法无法监测移植细胞存活能力这一基本的细胞生物学特性。已知当细胞处于生物活性状态时，氯化锰（MnCl2）可通过电压门控钙离子（Ca2+）通道进入细胞，并在细胞内积聚，产生T1缩短效应。因此，我们提出，锰增强MRI可用于监测hESC移植至心肌后细胞的存活情况。
在本视频中，我们将展示如何用 MnCl2 对人胚胎干细胞（hESC）进行标记，以及如何通过体外 MRI 清晰地观察这些细胞。同时，将利用 Ca2+ 通道激动剂和拮抗剂调节 Ca2+ 通道的生物学活性，以评估伴随的信号变化。

在本视频中，我们展示了如何使用氯化锰（MnCl2）标记人类胚胎干细胞（hESC），当细胞处于生物活性状态时，氯化锰可通过电压门控钙通道进入细胞。此外，我们还展示了将MnCl2作为细胞磁共振成像（MRI）对比剂，用于评估hESC的体外存活能力。

人类胚胎干细胞（hESC）已显示出修复受损心肌的能力。磁共振成像（MRI）已成为……

磁共振成像（MRI）已成为定位移植干细胞并深入理解再生机制的主要成像手段。这些MRI研究通常使用氧化铁纳米颗粒作为成像对比剂。然而，铁颗粒可能在干细胞死亡后仍残留在组织中，并可被巨噬细胞摄取，从而导致无法准确追踪存活的移植细胞。本视频将展示氯化锰是一种有效的替代方案。与氧化铁标记相比，使用氯化游戏副本作为对比剂标记具有多项优势。例如，锰产生的是阳性信号，而铁颗粒则产生阴性信号。此外，已知锰离子可通过电压门控钙通道进入细胞，因此其在磁共振成像（MRI）中的显影表明存在具有生物活性的存活细胞。大家好，我是来自斯坦福大学心血管医学系Philip Yang实验室的Uni mother。今天我将向您展示如何使用锰对人类胚胎干细胞进行标记，以用于磁共振成像。该实验流程包括以下步骤：用对比剂标记人类胚胎干细胞、进行体外细胞磁共振成像以及分析MRI结果。现在我们开始。标记程序的第一步是准备在无胎牛条件下培养的人胚胎干细胞。为此，用胰蛋白酶消化细胞5分钟，然后加入培养基中和胰蛋白酶。接着，在20摄氏度下以800 RRP M离心5分钟，使细胞沉淀。将细胞悬液用 PBS 重悬后，通过台盼蓝染色计数细胞。根据获得的细胞数量，将细胞分装至锥形管中，每管含有所需数量的细胞。在此例中，我将细胞分为四管，每管 300 万个细胞。在开始锰标记前，再次通过离心收集细胞，并用 0.9% 氯化钠溶液溶解新鲜的氯化锰，配制 0.1 毫摩尔的氯化锰溶液。为了观察钙通道活性，我们准备了样品。第一个样品为对照组，其中包含仅在0.9%氯化钠中孵育的细胞。第二个样品包含在0.1毫摩尔氯化锰中孵育的细胞，样品三和样品四则分别包含在0.1毫摩尔氯化锰中孵育的细胞，并分别加入5微摩尔钙通道激动剂AK 8 6 44或250微摩尔钙通道阻断剂。接下来，将四个样品在37摄氏度、5% CO2条件下孵育30分钟。30分钟后，在20摄氏度下以800 RPM离心5分钟，使细胞沉淀。然后吸除上清液，并用PBS洗涤标记的细胞两次。洗涤后，将每个沉淀物重悬于200 µL PBS中，并转移至PCR管中。这些细胞通常为白色。好的，我们已完成用于比较的锰标记细胞的制备。我们还将使用更传统的铁标记方法来制备细胞，以开始铁标记实验。将尼克的临床级鱼精蛋白硫酸盐用蒸馏水配制成1 mg/mL的储备液。接着，在含有人胚胎干细胞培养基的试管中，加入终浓度为100 µg/mL的菲洛姆氧化物（film oxide）和12 µg/mL的鱼精蛋白硫酸盐。然后将溶液混匀5分钟。混匀溶液后，取等体积的混合溶液与细胞培养基加入细胞中，使氧化物的终浓度为50微克/毫升，鱼精蛋白硫酸盐的终浓度为6微克/毫升。孵育12小时后，用PBS洗涤细胞两次，最后一次洗涤液中加入含10单位/毫升肝素的PBS，以溶解细胞外的氧化物-蛋白硫酸复合物。洗涤后用胰酶消化细胞，获得单细胞悬液，随后对细胞进行计数，并分装至所需数量的样品中。本实验中，我准备了两个样本，一个含有100万个细胞，另一个含有300万个细胞。接下来是P细胞，这些沉淀应呈橙色至棕色。最后，我们将每个沉淀用200 µL PBS重悬，并转移至PCL管中。好了，我们已完成细胞标记。接下来进行细胞磁共振成像。开始成像前，我们首先制作一个模体，用于固定含有细胞样本的试管，并避免扫描过程中周围空气产生伪影。为此，将1%的硫酸铜和0.8%的琼脂溶于蒸馏水中，通过微波加热5至7分钟至沸腾。将该混合液冷却至少一小时，使其形成凝胶。随后，将含有标记细胞沉淀的试管放入模体中进行扫描。使用3.0 T磁共振成像仪和临床膝关节线圈进行体外细胞磁共振成像。我们采用GE Medical Systems生产的Signa设备，对四个样本中的锰标记细胞进行扫描，扫描序列使用自旋回波序列。该序列的参数是根据先前对标记细胞进行的T映射研究确定的。我们采用的参数为：回波时间最短，重复时间为800毫秒，视野为12×12厘米，矩阵为256×256。下一步，使用梯度回波序列扫描铁标记的细胞。我们采用以下参数进行成像：回波时间为10毫秒，重复时间为100毫秒，翻转角度为30度，视野为12厘米×12厘米，矩阵为256×256，以及下一个参数。好的，我们已经完成了成像。现在让我们来看一下结果。以下是四种不同锰标记细胞样本的MRI扫描结果。样品一为对照组，其中含有仅在0.9%氯化钠中孵育的细胞。样品二含有在0.1毫摩尔氯化锰中孵育的细胞。样品三含有在0.1毫摩尔氯化锰及五微克钙通道激动剂vacay 8 6 4 4中孵育的细胞。4号样品包含在0.1百万MO氯化锰和250微摩尔钙通道拮抗剂维拉帕米中孵育的细胞。与仅用锰标记的细胞相比，在钙通道激动剂存在时信号强度增加，而在钙通道拮抗剂存在时信号强度降低。锰标记细胞信号增强区域通过ImageJ进行测量。该结果表明锰确实通过电压门控钙通道进入细胞。现在让我们将此结果与铁标记细胞的结果进行比较。注意锰标记细胞产生的明亮阳性信号与铁标记细胞产生的暗黑色阴性信号之间的差异。我们刚刚向您展示了如何对人胚胎干细胞进行锰标记，以用于体外细胞磁共振成像。该方法是一种有效的干细胞示踪技术，原因如下：第一，锰离子可通过简单的30分钟孵育高效进入细胞；第二，锰标记的细胞可产生具有正性信号的清晰图像；第三，锰通过电压门控钙通道进入细胞，这一点已通过钙通道激动剂和拮抗剂的实验得到证实，因此仅进入具有活性的细胞。因此，我们认为，对人胚胎干细胞进行锰标记在活体细胞磁共振成像中具有巨大潜力，可用于精确追踪移植的人胚胎干细胞在缺血性损伤区域的作用效果。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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