产生稳定的转基因C.使用微量注射线虫

Sea elegance 是一种非常有用的模式生物，因为我们既了解它的细胞谱系，又通过对其整个基因组进行测序和分析而产生的大量信息。在本视频中，我们演示了将质粒显微注射到 Sea Elegance 中的过程以及使用荧光显微镜选择转基因后代作为透明和多细胞动物，Sea Elegance 非常适合在体内可视化表达荧光标记蛋白的转基因。大家好，我叫 Laura Berkowitz，是阿拉巴马大学生物科学系考德威尔实验室的一名研究助理。

我是 Adam Knight，也来自阿拉巴马大学 Calwell 实验室。今天，我将向您展示如何准备和进行纤溶酶显微注射以产生转基因海优雅，我将向您展示如何选择和保持转基因海豹优雅品系。那么让我们开始吧。

在开始显微注射之前，我们有一些准备步骤，现在我将向您展示。首先，准备要注射的质粒 DNA，需要两个质粒，一个编码我们目标基因的组织特异性表达，另一个提供可选择的转化标记。将质粒以 50 ng/μL 的一比一比例混合在一起。

接下来，准备螺旋垫，用于固定蠕虫进行注射。要制作螺旋垫，首先在工作台上放置几个 22 x 50 毫米的盖玻片。使用牧场移液器将一滴融化的 2%agros 放在一个盖玻片上，然后立即将第二个盖玻片与第一个盖玻片成 90 度角放在液滴上。

让 Aero 凝固几秒钟，然后取下顶盖玻璃。aero 扁平圆盘的直径应在 15 到 20 毫米之间。像宠物一样，让垫子完全风干几个小时或过夜。

干燥后，将垫子在室温下存放在盖玻片盒中。接下来，准备用于 DNA 溶液的穿针器。为此，取 100 微升毛细管，在明火中间加热，然后迅速将其拉至大约两倍的长度。

毛细管冷却后，将两半分开。储备 10 到 20 个注射装针器。您可以将它们直立存放在微量离心管中。

布拉克，小心点。装针点非常锋利。现在制作微型注射针。

这些针头由包含内部玻璃丝的特殊毛细管制成。该细丝用作 DNA 溶液的灯芯。为了制作针头，我们使用 Niki PP 8 30 Polar 加热设置为 24.8，一次拉出几根针进行存放。

可以将多个针安装在一条造型粘土上。将使用盖玻片的小碎片来打破拉出的针尖。这些碎片的制备方法是将 18 x 18 毫米的盖玻片包裹在 Kim 抹布中，然后轻轻施加压力，直到它碎成几块。

使用大小约为 3 x 4 毫米的分片。除了准备 DNA 和针头外，还准备大约 50 到 100 个适当分期的针头。每个要注射的表达载体构建体有两个野生型蠕虫。

我们现在已准备好设置显微注射显微镜。要开始设置显微镜，请打开连接到显微注射针臂和支架的氦气罐上的主阀。关闭调节器，让气体进入管路。

将压力提高到 35 PSI 后，可以使用脚踏板释放气体。接下来，将进针器插入标准口移液器管中，滴入少量质粒混合物约 1 微升。现在轻轻地将加载器完全插入显微注射针头，直到感觉到阻力。

轻轻吹气排出 DNA 溶液，然后取下加载器。加载 DNA 后，将针头插入显微注射臂，小心地将其放入内部小橡胶垫圈中，然后将其夹在机械臂上。接下来，将盖玻片的断针碎片放在螺旋垫的一侧。

用神圣碳油覆盖碎片以及螺旋垫的整个表面。然后将俄歇垫放在倒置显微镜的载物台上。螺旋垫就位后，使用 Forex 物镜和明场照明将指针定位在观察场的中心，但不要将其放入油中。

接下来，将盖板玻璃碎片的内边缘放在中心，然后聚焦于它。将针头放入油中，使其与盖玻片处于同一焦平面。通过切换到 40 倍物镜来提高放大倍率，然后重新聚焦在碎片的边缘，并在必要时重新定位针尖。

现在打破 Open 注射针的尖端。轻轻地将针头推向盖玻片的边缘，同时通过脚踏板施加短促的气体脉冲。针头将被充分打开。

当小液滴从针头末端逸出时，由于液体流量过大，液体流量过大，开口是不可取的，因为它会杀死动物。针头准备好后，我们开始显微注射。接下来，通过向上抬起针头从载物台上取下螺旋垫。

但不要更改 X 或 Y 轴位置。将载物台从针头下方滑出。取下螺旋垫并将其放在解剖显微镜上。

将一个单词转移到油表面下方的垫子上。如果蠕虫轻轻地蠕动它，直到它接触到螺旋垫，潮湿的蠕虫应该会粘附在干燥的农产品上。快速将螺旋垫放回舞台上，使蠕虫在视野中居中。

然后将针降低到与蠕虫相同的焦点平面中。将倒置示波器上的滤光片切换到 Hoffman 照明。此对比滤镜使蠕虫的形态细节变得可见。

使用 40 倍物镜，专注于胚核蜂窝状图案下方蠕虫性腺的颗粒状感觉中心。选择位于蠕虫面向针头的一侧的性腺。好。调整针的位置，直到针尖也清晰对焦。

轻轻地将针头插入性腺中心，并施加短暂的气压脉冲，将一两滴 DNA 喷射到性腺臂中。您应该通过大量的练习和技巧观察到一波液体散布在远端刺激物上。你每次都可以点击刺激中心。

请记住，在注射蠕虫时快速工作很重要。因为它很容易干燥。理想情况下，整个过程应该不到一到两分钟。

注射完成后，从载物台上取下螺旋垫并将其放在解剖镜上。将 1 微升 M nine 缓冲液直接涂抹在注射的蠕虫上。这可能需要将移液器吸头浸入 halo carb oil 表面以下。

缓冲液应使蠕虫再水化，然后它会从 aeros 垫表面漂浮，使用蠕虫镐将蠕虫转移到普通板上。现在我将注射的蠕虫交给 Adam，他将向我们展示转基因品系的选择和维护。将注射的蠕虫转移到单个新鲜接种的 60 毫米平板上并允许繁殖。

这些蠕虫代表 P 零代。通常，注射的动物在 20 摄氏度下孵育 2 到 3 天，直到后代出现。一旦后代出现，我们就可以开始筛选转基因蠕虫了。

观察 F1 后代以获取转基因标记的证据。在这种情况下，可选择的标记物是荧光的，因此我们可以使用荧光立体显微镜进行筛选。将每只荧光载体 F1 动物分别克隆到新板上。

注射的 P zero 在其所有 F1 中只能产生 1 到 5 个荧光后代。让 F1 雌雄同体在 20 度下繁殖两到三天，直到后代出现。一旦 F 第二代准备好，它们也会被观察转基因动物。F 两只遗传并表达转基因标记的动物被认为是稳定系。

每个独立的稳定系应保持为单独的蠕虫系，通过在每代将几个转基因动物转移到新板中来繁殖每个系。这必须使用荧光立体显微镜进行。如果可选择的标记物是荧光的，以控制基因拷贝数的变异性，则每个注射的构建体至少生成三个独立的稳定细胞系。

我们刚刚向您展示了如何微注射表达、载体构建体，并查看 elgan 并选择稳定的细胞系。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。