Name: 产生稳定的转基因C.使用微量注射线虫 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-15T12:12:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: 学习利用显微注射技术向秀丽隐杆线虫生殖腺注入质粒DNA，通过荧光筛选获得稳定转基因品系。该方法适用于神经科学与遗传学研究，可实时观察基因表达。

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我们谨向Caldwell实验室所有成员的合作精神表示感谢。本实验室的运动障碍研究得到了Bachmann-Strauss肌张力障碍与帕金森基金会、美国帕金森基金会、美国帕金森病协会、阿拉巴马州帕金森病协会、迈克尔·J·福克斯帕金森病研究基金会以及本科生研究项目的支持。

表达质粒构建
需要两种质粒：一种用于目的基因的组织特异性表达，另一种作为可选择的转化标记。
实验质粒
<ol>
<li>选择在目标组织/细胞类型中表达的启动子，例如神经或肌肉特异性启动子。若需在同一组织中表达多个基因，可使用 Gateway 系统（Invitrogen）中的启动子盒质粒。该方法可通过重组克隆将任何目的基因插入启动子的下游4。通常，上游序列长度为 2–5 kb 即可实现正确且精确的表达。 </li>
<li>目的基因的 cDNA 可通过两种方法进行克隆：<ol>
<li>使用限制性内切酶进行传统克隆。</li>
<li>对于 Gateway 克隆，需使用含有 Gateway att B 重组序列的引物通过 PCR 扩增获得 cDNA。将扩增后的 cDNA 首先与供体载体 pDONR201 进行重组以构建入门载体，然后转化至 E. coli DH5α 菌株中。在筛选出成功的重组子并进行质粒小量提取后，将入门载体与含有启动子的目的载体进行重组，从而构建表达质粒。有关重组克隆的详细信息可参见 Invitrogen Gateway 手册或 Caldwell 等人5的研究。</li>
</ol></li>
</ol>
可筛选标记质粒
转基因标记质粒的示例包括 rol-6，或使用体壁肌肌动蛋白启动子 unc-54 驱动荧光蛋白的表达。这些标记质粒通常可根据要求从科研社区获得。
秀丽隐杆线虫的显微注射
准备
<ol>
<li>对将要注射的两种质粒进行DNA提取。定量后，将它们以每种50 ng/µl的浓度按1:1比例混合。 </li>
<li>制备琼脂垫：<ol>
<li>用去离子水配制2%的琼脂糖溶液，加热或微波至完全溶解。</li>
<li>在实验台上放置若干片22 × 50 mm的盖玻片。</li>
<li>使用巴斯德吸管，将一滴熔化的琼脂糖溶液滴在一片盖玻片上，立即以90度角将另一片盖玻片覆盖在液滴上。对其他几片盖玻片重复此操作。压平后的琼脂糖圆盘直径应在15–20 mm之间。</li>
<li>待琼脂糖凝固（仅需数秒）后，移去上层盖玻片，并让琼脂垫在空气中彻底干燥（数小时至过夜）。</li>
<li>将制备好的琼脂垫存放于盖玻片盒中，室温保存。 </li>
</ol></li>
<li>制备用于DNA溶液的进样毛细管： 进样毛细管由100 µl的毛细管制成，将其在明火上中间部位加热后迅速拉伸至原长度的约两倍。待毛细管冷却后，将其折断为两段。为注射准备10–20根进样毛细管，并直立存放于微量离心管架中。操作时需小心，避免被尖端刺伤。 </li>
<li>制备显微注射针： 显微注射针由含有内部玻璃丝的特殊毛细管拉制而成；该玻璃丝可作为DNA溶液的导流芯。使用针头拉制仪进行拉制。我们使用Narishige PP-830拉针仪，加热参数设置为24.8。可同时拉制多个针头，并存放于小型塑料盒中。多个针头可方便地“固定”在一条模型黏土条上，用于长期保存。 </li>
<li>针尖“破口器”： 显微注射针的针尖被拉得极细，末端实际是封闭的，需使用小片盖玻片将其轻触破开。破口器的制备方法为：将一块18 × 18 mm的盖玻片用纸巾包裹，轻轻施加压力使其碎裂成若干片。大小约为3 × 4 mm的碎片较为适用。 </li>
<li>按照标准操作方法6将野生型（N2）线虫培养至早期成虫阶段用于注射。每种构建体注射时准备约100条发育阶段合适的线虫。</li>
</ol>
实验步骤
<ol>
<li>打开连接至显微注射针臂和持针器的氦气瓶主阀。关闭调压阀，使气体进入管路，将压力升至35 psi。注意可通过脚踏板释放气体。 </li>
<li>将针式加样器插入标准口径移液管软管（见于玻璃毛细管容器中），吸取少量质粒混合物（约 1 µl）。 </li>
<li>将针头装载器小心插入注射针的后端，轻柔地沿针管全长推进，直至遇到阻力。轻轻吹出DNA溶液，然后取出装载器。 </li>
<li>将针头插入显微注射臂，注意将其置于内部的小型橡胶垫圈内。 </li>
<li>在琼脂垫的一侧边缘放置一片用于折断针头的盖玻片碎片。用卤代烃油覆盖该碎片以及琼脂垫的整个表面。将琼脂垫置于倒置显微镜的载物台上。 </li>
<li>使用4倍物镜和明场照明，将针头置于视野中央，但暂不将其浸入油中。同时，将盖玻片碎片的内边缘置于视野中心，并对其进行聚焦（仍使用4倍物镜）。将针头缓慢 lowered 浸入油中，使其与盖玻片碎片处于同一焦平面。通过切换至40倍物镜提高放大倍数，重新对盖玻片碎片边缘聚焦，并在必要时调整针尖位置。 </li>
<li>轻轻将注射针尖抵住盖玻片碎片的边缘，同时用脚踏板短暂地施加一次气体脉冲，以打开针尖。当针尖末端有小液滴渗出时，即表明针已充分打开。若开口过大导致液体过量流出，会杀死受试动物，应避免。 </li>
<li>将针头抬起，从载物台上取下琼脂垫，但不要改变X轴或Y轴位置。将载物台从针头下方滑出，取下琼脂垫并将其放置在解剖显微镜上。将一条线虫转移至琼脂垫上，位于油层表面之下。若线虫扭动，可轻轻触碰其身体，直至其接触琼脂垫。湿润的线虫应能黏附于干燥的琼脂糖表面。 </li>
<li>注射 <ol>
<li>迅速将琼脂垫放回载物台上，使线虫位于视野中央。</li>
<li>将针头降至与线虫相同的焦平面。</li>
<li>切换至霍夫曼照明（一种对比度滤光方式），以便观察线虫的形态细节。若倒置显微镜配备诺马尔斯基微分干涉（Nomarski/DIC）光学系统，亦可使用。使用40倍物镜，聚焦于线虫生殖腺中呈“颗粒状”的合胞体中心。&nbsp; 选择位于虫体朝向针头一侧的性腺（即位于生殖细胞核“蜂窝状”排列下方的性腺）。</li>
<li>微调针的位置，直至针尖也处于焦点平面（与性腺的“颗粒状”结构在同一平面）。</li>
<li>轻轻将针插入性腺中心，施加短暂的气体压力，将一至两滴 DNA 溶液注入性腺臂中。应可观察到液体波纹向远端性腺扩散。切勿认为注入液体越多越好，因为过量液体可能流入性腺臂近端弯曲处，从而抑制卵细胞的产生。若条件允许，根据线虫的位置，以相同方式注射另一侧性腺臂。</li>
<li>注射线虫时需迅速操作，因其容易脱水。是否注射第二条生殖腺臂取决于重新定位针头和线虫的速度。整个过程理想情况下应耗时不超过1-2分钟。 </li>
</ol></li>
<li>从载物台上取下盖玻片并置于解剖显微镜下。加入1µl M9缓冲液（22mM KH2PO4，42 mM Na2HPO4，85 mM NaCl，1 mM MgSO₄4将缓冲液直接滴加到已注射的线虫上（可能需要将移液器尖端浸入卤代烃油表面以下）。缓冲液会重新水合线虫，使其从琼脂糖垫表面漂浮起来。使用线虫挑取工具将线虫转移至普通培养皿中。琼脂糖垫可重复使用多次，直至被缓冲液过度饱和而无法再使线虫附着为止。</li>
</ol>
转基因筛选
<ol>
<li>将注射后的线虫（P0 代）转移到单独的新鲜细菌接种培养板（60 mm）上，使其繁殖。通常将注射后的个体在 20°C 下培养 2–3 天，直至后代出现。 </li>
<li>使用荧光体视显微镜观察 F1 代后代是否表现出转基因标记（如荧光）。将每只带有荧光信号的 F1 代携带者单独克隆至新的培养板上（因为每个 F1 个体的后代被视为一个独立的品系）。让 F1 代雌雄同体个体继续繁殖。此步骤通常也在 20°C 下进行 2–3 天，直至后代出现。 </li>
<li>同样观察 F2 代中是否存在转基因个体。那些继承并表达转基因阵列的 F2 个体被视为“稳定”品系。 注意：在 F1 代阶段可能会出现多个转基因个体，但它们并不稳定。大多数 F1 代转基因个体无法传递至 F2 代形成稳定品系。 注意：为控制基因拷贝数的变异性，每种注射的构建体应至少建立三个独立的稳定品系。 </li>
<li>每个独立的稳定品系应作为独立的线虫品系进行维持。通过在每一代将若干转基因个体转移至新培养板的方式进行扩繁；若筛选标记为荧光，则此操作必须在荧光体视显微镜下完成。</li>
</ol>

<ol><li>Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA+transformation+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).</li>
<li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li>
<li>Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+requirements+for+somatic+and+germline+expression+of+a+generally+expressed+Caenorhabditis+elegans+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene.</a> Genetics. 146, 227-238 (1997).</li>
<li>Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torsin-mediated+neuroprotection+from+cellular+stresses+to+dopaminergic+neurons+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans.</a> J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).</li>
<li>Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , John Wiley and Sons. West. Sussex, England. (2006).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
</ol>

进行此操作时，需注意以下几点： - 直接将液体注射至性腺中心 - 注射液体量不宜过多 - 操作应迅速，以防止干燥。
如果针头出现问题，例如断裂或开口过大，最好重新制作新的针头，而不应使用不理想的针头进行注射。
转基因线虫的制备具有多种应用，例如： - 通过称为转化拯救的方法鉴定突变基因 - 通过表达截短蛋白来定位蛋白结构域 - 鉴定基因在细胞及疾病过程中的作用。

<table><tbody><tr><td>琼脂糖</td><td>超纯级</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>卤碳油，Voltalef</td><td>Hulle 10S</td><td>elfatochem, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 18x18 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-A</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 20x30 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5A</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 22x50 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-E</td><td></td></tr><tr><td>100 µl 毛细管</td><td></td><td>VWR international</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>针用玻璃毛细管</td><td>&quot;Kwik-Fil&quot;</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>拉针仪</td><td>工具</td><td>Narishige International</td><td>Model PP-830</td><td></td></tr><tr><td>微量注射系统</td><td></td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MINJ-1000</td><td>显微镜、载物台、操纵器</td></tr><tr><td>带荧光功能的体视显微镜</td><td>显微镜</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>显微镜</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ645</td><td></td></tr></tbody></table>

利用显微注射法构建稳定的转基因秀丽隐杆线虫

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

通过将DNA质粒溶液显微注射到秀丽隐杆线虫的性腺中，可轻松构建转基因秀丽隐杆线虫 1质粒DNA会重排形成游离于染色体外的串联多联体，可稳定遗传，但其遗传效率不及真正的染色体 2将目的基因与一个具有明显表型标记的基因（如 rol-6 或 GFP）共同注射，以便在解剖显微镜下筛选转基因动物。外源基因可由其天然启动子驱动，用于细胞定位研究；或者，也可由另一种组织特异性启动子驱动，以评估该基因产物在特定细胞或组织中的功能。该技术可高效地在秀丽隐杆线虫（C. elegans）除生殖系或早期胚胎以外的所有组织中驱动基因表达。 3转基因动物的创建被广泛应用于多种实验研究范式中。本视频展示了通过显微注射技术制备转基因线虫的方法。此外，还介绍了稳定转基因秀丽隐杆线虫品系的筛选与维持方法。

本视频演示了通过显微注射将外源DNA导入秀丽隐杆线虫（C. elegans）生殖腺以创建转基因动物的技术。

通过将DNA质粒溶液显微注射到秀丽隐杆线虫的生殖腺中，可轻松构建转基因秀丽隐杆线虫1。质粒DNA会重排形成…

秀丽线虫是一种极为有用的模式生物，原因在于我们对其细胞谱系已有深入了解，同时其全基因组测序与分析也产生了大量信息。在本视频中，我们将演示将质粒显微注射到秀丽线虫中的过程，并利用荧光显微镜筛选转基因后代。作为一种透明且多细胞的动物，秀丽线虫非常适合在活体中观察表达荧光标记蛋白的转基因。大家好，我叫 Laura Berkowitz，是阿拉巴马大学生物科学系 Caldwell 实验室的一名研究助理。我是亚当·Knight（Adam Knight），同样来自阿拉巴马大学的Caldwell实验室。今天我将向您展示如何准备并实施纤溶酶微注射，以获得转基因海兔（sea elegance），以及如何筛选和维持转基因海兔品系。现在让我们开始吧。在开始显微注射之前，我们需要完成一些准备工作，我现在将向您展示这些步骤。首先，准备好待注射的质粒DNA，需要两种质粒：一种编码目的基因的组织特异性表达，另一种提供可筛选的转化标记。将这两种质粒以每微升各50纳克的等量比例混合。接下来，制备螺口垫片，用于固定线虫以进行显微注射。制备螺口垫片时，首先在实验台面上放置数片22 mm × 50 mm的盖玻片。使用移液管吸取一滴融化的2%琼脂糖，滴加在一片盖玻片上，随即以90度角将另一片盖玻片覆盖在液滴之上。让气凝胶静置数秒使其固化，然后移除顶部的盖玻片。气凝胶压平后的圆盘直径应在15至20毫米之间。如同照料宠物一般，让该垫材在空气中彻底干燥数小时或过夜。干燥后，将垫片存放在盖玻片盒中，于室温下保存。接下来，准备用于DNA溶液的上样针。操作时，取一支100 µL毛细管，将其置于明火中部加热，然后迅速拉伸至原长度的约两倍。毛细管冷却后，将其两端折断分开。准备10至20个针头装载管用于注射。可将其直立存放于微量离心管中。Brack，小心。进样针的针尖非常锋利。现在开始制备显微注射针。这些针由一种特殊的毛细管制成，管内含有玻璃丝。该玻璃丝可作为DNA溶液的灯芯。制作针时，我们使用Niki PP eight 30 Polar拉针仪，设定加热温度为24.8，可同时制备多根针以供储存。可将多根针固定在一条造型粘土上。使用盖玻片的小碎片来打开拉制的针尖。这些碎片的制备方法是：用无尘纸包裹一块18×18毫米的盖玻片，轻轻施压，使其破裂成若干小片。使用大小约为 3 × 4 毫米的载片。除了准备 DNA 和微针外，还需准备约 50 至 100 个发育阶段合适的线虫，每种表达载体构建体需准备两个野生型线虫用于显微注射。现在我们准备设置显微注射显微镜。开始设置显微镜时，打开连接到显微注射针臂和持针器的氦气瓶主阀。关闭调节阀，使气体进入管路。将压力升至35 PSI后，可通过脚踏板释放气体。接下来，将一个针式装载器插入标准口径的移液管管路中，并滴加约一微升的质粒混合物。然后，轻柔地将装载器完全插入显微注射针头，直至感到阻力为

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

产生稳定的转基因C.使用微量注射线虫

转基因线虫在秀丽隐杆线虫（C.

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利用由fosmid携带的基因组DNA为Caenorhabditis...

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本视频介绍了显微注射技术，这是一种创建转基因C.

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关键词：转基因小鼠，卵母细胞，显微注射，基因修饰，胚胎操作

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