Name: 产生稳定的转基因C.使用微量注射线虫 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-15T12:12:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: 学习利用显微注射技术向秀丽隐杆线虫生殖腺注入质粒DNA，通过荧光筛选获得稳定转基因品系。该方法适用于神经科学与遗传学研究，可实时观察基因表达。

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我们谨向Caldwell实验室所有成员的合作精神表示感谢。本实验室的运动障碍研究得到了Bachmann-Strauss肌张力障碍与帕金森基金会、美国帕金森基金会、美国帕金森病协会、阿拉巴马州帕金森病协会、迈克尔·J·福克斯帕金森病研究基金会以及本科生研究项目的支持。

表达质粒构建
需要两种质粒：一种用于目的基因的组织特异性表达，另一种作为可选择的转化标记。
实验质粒
<ol>
<li>选择在目标组织/细胞类型中表达的启动子，例如神经或肌肉特异性启动子。若需在同一组织中表达多个基因，可使用 Gateway 系统（Invitrogen）中的启动子盒质粒。该方法可通过重组克隆将任何目的基因插入启动子的下游4。通常，上游序列长度为 2–5 kb 即可实现正确且精确的表达。 </li>
<li>目的基因的 cDNA 可通过两种方法进行克隆：<ol>
<li>使用限制性内切酶进行传统克隆。</li>
<li>对于 Gateway 克隆，需使用含有 Gateway att B 重组序列的引物通过 PCR 扩增获得 cDNA。将扩增后的 cDNA 首先与供体载体 pDONR201 进行重组以构建入门载体，然后转化至 E. coli DH5α 菌株中。在筛选出成功的重组子并进行质粒小量提取后，将入门载体与含有启动子的目的载体进行重组，从而构建表达质粒。有关重组克隆的详细信息可参见 Invitrogen Gateway 手册或 Caldwell 等人5的研究。</li>
</ol></li>
</ol>
可筛选标记质粒
转基因标记质粒的示例包括 rol-6，或使用体壁肌肌动蛋白启动子 unc-54 驱动荧光蛋白的表达。这些标记质粒通常可根据要求从科研社区获得。
秀丽隐杆线虫的显微注射
准备
<ol>
<li>对将要注射的两种质粒进行DNA提取。定量后，将它们以每种50 ng/µl的浓度按1:1比例混合。 </li>
<li>制备琼脂垫：<ol>
<li>用去离子水配制2%的琼脂糖溶液，加热或微波至完全溶解。</li>
<li>在实验台上放置若干片22 × 50 mm的盖玻片。</li>
<li>使用巴斯德吸管，将一滴熔化的琼脂糖溶液滴在一片盖玻片上，立即以90度角将另一片盖玻片覆盖在液滴上。对其他几片盖玻片重复此操作。压平后的琼脂糖圆盘直径应在15–20 mm之间。</li>
<li>待琼脂糖凝固（仅需数秒）后，移去上层盖玻片，并让琼脂垫在空气中彻底干燥（数小时至过夜）。</li>
<li>将制备好的琼脂垫存放于盖玻片盒中，室温保存。 </li>
</ol></li>
<li>制备用于DNA溶液的进样毛细管： 进样毛细管由100 µl的毛细管制成，将其在明火上中间部位加热后迅速拉伸至原长度的约两倍。待毛细管冷却后，将其折断为两段。为注射准备10–20根进样毛细管，并直立存放于微量离心管架中。操作时需小心，避免被尖端刺伤。 </li>
<li>制备显微注射针： 显微注射针由含有内部玻璃丝的特殊毛细管拉制而成；该玻璃丝可作为DNA溶液的导流芯。使用针头拉制仪进行拉制。我们使用Narishige PP-830拉针仪，加热参数设置为24.8。可同时拉制多个针头，并存放于小型塑料盒中。多个针头可方便地“固定”在一条模型黏土条上，用于长期保存。 </li>
<li>针尖“破口器”： 显微注射针的针尖被拉得极细，末端实际是封闭的，需使用小片盖玻片将其轻触破开。破口器的制备方法为：将一块18 × 18 mm的盖玻片用纸巾包裹，轻轻施加压力使其碎裂成若干片。大小约为3 × 4 mm的碎片较为适用。 </li>
<li>按照标准操作方法6将野生型（N2）线虫培养至早期成虫阶段用于注射。每种构建体注射时准备约100条发育阶段合适的线虫。</li>
</ol>
实验步骤
<ol>
<li>打开连接至显微注射针臂和持针器的氦气瓶主阀。关闭调压阀，使气体进入管路，将压力升至35 psi。注意可通过脚踏板释放气体。 </li>
<li>将针式加样器插入标准口径移液管软管（见于玻璃毛细管容器中），吸取少量质粒混合物（约 1 µl）。 </li>
<li>将针头装载器小心插入注射针的后端，轻柔地沿针管全长推进，直至遇到阻力。轻轻吹出DNA溶液，然后取出装载器。 </li>
<li>将针头插入显微注射臂，注意将其置于内部的小型橡胶垫圈内。 </li>
<li>在琼脂垫的一侧边缘放置一片用于折断针头的盖玻片碎片。用卤代烃油覆盖该碎片以及琼脂垫的整个表面。将琼脂垫置于倒置显微镜的载物台上。 </li>
<li>使用4倍物镜和明场照明，将针头置于视野中央，但暂不将其浸入油中。同时，将盖玻片碎片的内边缘置于视野中心，并对其进行聚焦（仍使用4倍物镜）。将针头缓慢 lowered 浸入油中，使其与盖玻片碎片处于同一焦平面。通过切换至40倍物镜提高放大倍数，重新对盖玻片碎片边缘聚焦，并在必要时调整针尖位置。 </li>
<li>轻轻将注射针尖抵住盖玻片碎片的边缘，同时用脚踏板短暂地施加一次气体脉冲，以打开针尖。当针尖末端有小液滴渗出时，即表明针已充分打开。若开口过大导致液体过量流出，会杀死受试动物，应避免。 </li>
<li>将针头抬起，从载物台上取下琼脂垫，但不要改变X轴或Y轴位置。将载物台从针头下方滑出，取下琼脂垫并将其放置在解剖显微镜上。将一条线虫转移至琼脂垫上，位于油层表面之下。若线虫扭动，可轻轻触碰其身体，直至其接触琼脂垫。湿润的线虫应能黏附于干燥的琼脂糖表面。 </li>
<li>注射 <ol>
<li>迅速将琼脂垫放回载物台上，使线虫位于视野中央。</li>
<li>将针头降至与线虫相同的焦平面。</li>
<li>切换至霍夫曼照明（一种对比度滤光方式），以便观察线虫的形态细节。若倒置显微镜配备诺马尔斯基微分干涉（Nomarski/DIC）光学系统，亦可使用。使用40倍物镜，聚焦于线虫生殖腺中呈“颗粒状”的合胞体中心。&nbsp; 选择位于虫体朝向针头一侧的性腺（即位于生殖细胞核“蜂窝状”排列下方的性腺）。</li>
<li>微调针的位置，直至针尖也处于焦点平面（与性腺的“颗粒状”结构在同一平面）。</li>
<li>轻轻将针插入性腺中心，施加短暂的气体压力，将一至两滴 DNA 溶液注入性腺臂中。应可观察到液体波纹向远端性腺扩散。切勿认为注入液体越多越好，因为过量液体可能流入性腺臂近端弯曲处，从而抑制卵细胞的产生。若条件允许，根据线虫的位置，以相同方式注射另一侧性腺臂。</li>
<li>注射线虫时需迅速操作，因其容易脱水。是否注射第二条生殖腺臂取决于重新定位针头和线虫的速度。整个过程理想情况下应耗时不超过1-2分钟。 </li>
</ol></li>
<li>从载物台上取下盖玻片并置于解剖显微镜下。加入1µl M9缓冲液（22mM KH2PO4，42 mM Na2HPO4，85 mM NaCl，1 mM MgSO₄4将缓冲液直接滴加到已注射的线虫上（可能需要将移液器尖端浸入卤代烃油表面以下）。缓冲液会重新水合线虫，使其从琼脂糖垫表面漂浮起来。使用线虫挑取工具将线虫转移至普通培养皿中。琼脂糖垫可重复使用多次，直至被缓冲液过度饱和而无法再使线虫附着为止。</li>
</ol>
转基因筛选
<ol>
<li>将注射后的线虫（P0 代）转移到单独的新鲜细菌接种培养板（60 mm）上，使其繁殖。通常将注射后的个体在 20°C 下培养 2–3 天，直至后代出现。 </li>
<li>使用荧光体视显微镜观察 F1 代后代是否表现出转基因标记（如荧光）。将每只带有荧光信号的 F1 代携带者单独克隆至新的培养板上（因为每个 F1 个体的后代被视为一个独立的品系）。让 F1 代雌雄同体个体继续繁殖。此步骤通常也在 20°C 下进行 2–3 天，直至后代出现。 </li>
<li>同样观察 F2 代中是否存在转基因个体。那些继承并表达转基因阵列的 F2 个体被视为“稳定”品系。 注意：在 F1 代阶段可能会出现多个转基因个体，但它们并不稳定。大多数 F1 代转基因个体无法传递至 F2 代形成稳定品系。 注意：为控制基因拷贝数的变异性，每种注射的构建体应至少建立三个独立的稳定品系。 </li>
<li>每个独立的稳定品系应作为独立的线虫品系进行维持。通过在每一代将若干转基因个体转移至新培养板的方式进行扩繁；若筛选标记为荧光，则此操作必须在荧光体视显微镜下完成。</li>
</ol>

<ol><li>Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA+transformation+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).</li>
<li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li>
<li>Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+requirements+for+somatic+and+germline+expression+of+a+generally+expressed+Caenorhabditis+elegans+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene.</a> Genetics. 146, 227-238 (1997).</li>
<li>Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torsin-mediated+neuroprotection+from+cellular+stresses+to+dopaminergic+neurons+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans.</a> J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).</li>
<li>Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , John Wiley and Sons. West. Sussex, England. (2006).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
</ol>

进行此操作时，需注意以下几点： - 直接将液体注射至性腺中心 - 注射液体量不宜过多 - 操作应迅速，以防止干燥。
如果针头出现问题，例如断裂或开口过大，最好重新制作新的针头，而不应使用不理想的针头进行注射。
转基因线虫的制备具有多种应用，例如： - 通过称为转化拯救的方法鉴定突变基因 - 通过表达截短蛋白来定位蛋白结构域 - 鉴定基因在细胞及疾病过程中的作用。

<table><tbody><tr><td>琼脂糖</td><td>超纯级</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>卤碳油，Voltalef</td><td>Hulle 10S</td><td>elfatochem, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 18x18 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-A</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 20x30 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5A</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 22x50 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-E</td><td></td></tr><tr><td>100 µl 毛细管</td><td></td><td>VWR international</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>针用玻璃毛细管</td><td>&quot;Kwik-Fil&quot;</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>拉针仪</td><td>工具</td><td>Narishige International</td><td>Model PP-830</td><td></td></tr><tr><td>微量注射系统</td><td></td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MINJ-1000</td><td>显微镜、载物台、操纵器</td></tr><tr><td>带荧光功能的体视显微镜</td><td>显微镜</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>显微镜</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ645</td><td></td></tr></tbody></table>

利用显微注射法构建稳定的转基因秀丽隐杆线虫

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

通过将DNA质粒溶液显微注射到秀丽隐杆线虫的性腺中，可轻松构建转基因秀丽隐杆线虫 1质粒DNA会重排形成游离于染色体外的串联多联体，可稳定遗传，但其遗传效率不及真正的染色体 2将目的基因与一个具有明显表型标记的基因（如 rol-6 或 GFP）共同注射，以便在解剖显微镜下筛选转基因动物。外源基因可由其天然启动子驱动，用于细胞定位研究；或者，也可由另一种组织特异性启动子驱动，以评估该基因产物在特定细胞或组织中的功能。该技术可高效地在秀丽隐杆线虫（C. elegans）除生殖系或早期胚胎以外的所有组织中驱动基因表达。 3转基因动物的创建被广泛应用于多种实验研究范式中。本视频展示了通过显微注射技术制备转基因线虫的方法。此外，还介绍了稳定转基因秀丽隐杆线虫品系的筛选与维持方法。

本视频演示了通过显微注射将外源DNA导入秀丽隐杆线虫（C. elegans）生殖腺以创建转基因动物的技术。

通过将DNA质粒溶液显微注射到秀丽隐杆线虫的生殖腺中，可轻松构建转基因秀丽隐杆线虫1。质粒DNA会重排形成…

秀丽线虫是一种极为有用的模式生物，原因在于我们对其细胞谱系已有深入了解，同时其全基因组测序与分析也产生了大量信息。在本视频中，我们将演示将质粒显微注射到秀丽线虫中的过程，并利用荧光显微镜筛选转基因后代。作为一种透明且多细胞的动物，秀丽线虫非常适合在活体中观察表达荧光标记蛋白的转基因。大家好，我叫 Laura Berkowitz，是阿拉巴马大学生物科学系 Caldwell 实验室的一名研究助理。我是亚当·Knight（Adam Knight），同样来自阿拉巴马大学的Caldwell实验室。今天我将向您展示如何准备并实施纤溶酶微注射，以获得转基因海兔（sea elegance），以及如何筛选和维持转基因海兔品系。现在让我们开始吧。在开始显微注射之前，我们需要完成一些准备工作，我现在将向您展示这些步骤。首先，准备好待注射的质粒DNA，需要两种质粒：一种编码目的基因的组织特异性表达，另一种提供可筛选的转化标记。将这两种质粒以每微升各50纳克的等量比例混合。接下来，制备螺口垫片，用于固定线虫以进行显微注射。制备螺口垫片时，首先在实验台面上放置数片22 mm × 50 mm的盖玻片。使用移液管吸取一滴融化的2%琼脂糖，滴加在一片盖玻片上，随即以90度角将另一片盖玻片覆盖在液滴之上。让气凝胶静置数秒使其固化，然后移除顶部的盖玻片。气凝胶压平后的圆盘直径应在15至20毫米之间。如同照料宠物一般，让该垫材在空气中彻底干燥数小时或过夜。干燥后，将垫片存放在盖玻片盒中，于室温下保存。接下来，准备用于DNA溶液的上样针。操作时，取一支100 µL毛细管，将其置于明火中部加热，然后迅速拉伸至原长度的约两倍。毛细管冷却后，将其两端折断分开。准备10至20个针头装载管用于注射。可将其直立存放于微量离心管中。Brack，小心。进样针的针尖非常锋利。现在开始制备显微注射针。这些针由一种特殊的毛细管制成，管内含有玻璃丝。该玻璃丝可作为DNA溶液的灯芯。制作针时，我们使用Niki PP eight 30 Polar拉针仪，设定加热温度为24.8，可同时制备多根针以供储存。可将多根针固定在一条造型粘土上。使用盖玻片的小碎片来打开拉制的针尖。这些碎片的制备方法是：用无尘纸包裹一块18×18毫米的盖玻片，轻轻施压，使其破裂成若干小片。使用大小约为 3 × 4 毫米的载片。除了准备 DNA 和微针外，还需准备约 50 至 100 个发育阶段合适的线虫，每种表达载体构建体需准备两个野生型线虫用于显微注射。现在我们准备设置显微注射显微镜。开始设置显微镜时，打开连接到显微注射针臂和持针器的氦气瓶主阀。关闭调节阀，使气体进入管路。将压力升至35 PSI后，可通过脚踏板释放气体。接下来，将一个针式装载器插入标准口径的移液管管路中，并滴加约一微升的质粒混合物。然后，轻柔地将装载器完全插入显微注射针头，直至感到阻力为止。轻轻吹气排出DNA溶液，然后取下加样器。DNA加样完成后，将注射针插入显微注射臂，注意将其置于内部小型橡胶垫圈内，再将其夹紧固定在操纵臂上。接着，将一片盖玻片的碎片放在螺旋垫的一侧边缘处。用空心碳油覆盖碎片以及螺旋垫的整个表面。然后将螺旋垫放置在倒置显微镜的载物台上。待螺旋垫就位后，使用Forex物镜和明场照明，将针尖置于视野中央，但暂不将其降入油中。接下来，将盖玻片碎片的内边缘置于中心位置，然后对其聚焦。将针头下放至油中，使其与盖玻片碎片处于同一焦平面。通过切换至40倍物镜提高放大倍数，然后重新聚焦于盖玻片碎片的边缘，并在必要时调整针尖位置。现在将注射针的针尖折断打开。轻轻将针头抵住盖玻片碎片的边缘，同时通过脚踏板施加一个短暂的气体脉冲。针尖即可被充分打开。当液体的小液滴从针尖逸出时，由于过量液体流动，过大的开口是不可取的，因为它会杀死动物。针头准备好后，我们开始显微注射。接下来，通过将针头向上抬起，从载物台上移除螺杆垫片。但不要改变 X 轴或 Y 轴的位置。将载物台从针头下方滑出。取下螺旋垫片，将其放置到解剖显微镜上。将线虫转移至油面下方的加样垫上。若线虫轻微扭动，可轻轻触碰使其接触加样垫，湿润的线虫应会黏附于干燥的加样垫上。迅速将加样垫放回载物台，使线虫位于视野中央。然后将针头降至与线虫相同的焦平面。切换倒置显微镜的滤光片至霍夫曼（Hoffman）照明模式。该对比度滤光片可使线虫的形态细节变得可见。使用40倍物镜，聚焦于线虫性腺中位于生殖细胞核蜂窝状结构下方的颗粒状感觉中心。选择位于线虫朝向显微操作针一侧的性腺。微调显微操作针的位置，直至针尖也处于焦点范围内。轻轻将针插入性腺中心，并施加短暂的气体压力脉冲，将一两滴 DNA 液滴注入性腺臂中。经过大量练习和熟练操作后，您应能观察到液体波纹扩散至远端性腺。每次均可准确命中性腺中心。请注意，注射线虫时操作应迅速，因为线虫容易脱水。整个过程理想情况下应少于一到两分钟。注射完成后，将进样垫从载物台上取下并置于解剖显微镜下。将一微升 M9 缓冲液直接加到已注射的线虫上。此操作可能需要将移液器吸头浸入卤代烷油的液面以下。缓冲液应使线虫重新水化，随后线虫会从气溶胶垫表面漂浮起来，使用线虫挑取工具将线虫转移至普通培养皿。现在我将把注射后的线虫交给Adam，他将向我们展示转基因品系的筛选与维持过程。将注射后的线虫分别转移到新鲜涂布的60毫米培养皿中，使其繁殖后代。这些蠕虫代表 P0 代。通常将注射后的动物在 20 摄氏度下培养两到三天，直至后代出现。一旦后代出现，我们即可开始筛选转基因蠕虫。观察F1代子代，以确认转基因标记的存在。在此情况下，筛选标记具有荧光性，因此可使用荧光体视显微镜进行筛选。每只带有荧光标记的F1代个体需分别接种至新的培养板上。注射的P零代可能在所有F1代中仅产生一到五条荧光后代。让F1代雌雄同体在20摄氏度下繁殖两到三天，直至后代出现。一旦F2代准备就绪，也需对其进行观察以筛选转基因个体。那些继承并表达转基因标记的F2代个体被视为稳定品系。每个独立的稳定品系应作为单独的线虫品系进行维持，在每一代通过将若干转基因个体转移至新培养板来扩增每个品系。此操作必须使用荧光体视显微镜完成。若筛选标记为荧光蛋白，为控制基因拷贝数的变异，每种注射的构建体应至少建立三个独立的稳定品系。我们刚刚向您展示了如何进行显微注射表达载体构建体，以及如何筛选稳定的转基因品系。以上就是全部内容。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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通过卵母细胞显微注射制备转基因小鼠

关键词：转基因小鼠，卵母细胞，显微注射，基因修饰，胚胎操作

利用预先组装的Cas9核糖核蛋白复合物（RNP）是一种实现精确、高效基因组编辑的有力方法。本文重点介绍该方法在多种细胞和生物体中的应用，包括原代人源细胞以及经典和新兴的模式生物。...

利用Cas9核糖核蛋白在多种细胞和生物体中实现增强的基因组编辑

本文介绍了一种利用CRISPR-Cas9核糖核蛋白和同源依赖性修复模板对秀丽隐杆线虫（C.

使用 CRISPR/Cas9 核糖核蛋白在 C. elegans 中快速简便地生成基因组点突变的流程

针对寄生性线虫粪类圆线虫（Strongyloides stercoralis）和鼠类圆线虫（Strongyloides...

通过显微注射法在 Strongyloides 属物种中生成转基因株和基因敲除株

一种通过CRISPR/Cas9显微注射流程在Caenorhabditis...

利用CRISPR/Cas9介导的内源性荧光标记技术标记生殖系特异性基因 秀丽隐杆线虫

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