用于结核病及耐多药结核病诊断的MODS方法

全球每三个人中就有一人感染结核病。诊断活动性结核病可防止新的感染，因为未经治疗的活动性结核病患者每年会传染10至15人，直至接受治疗或死亡。MODS 是一个缩写词，我们使用它是为了避免重复表述“显微镜观察药物敏感性检测”，随着方法学的解释，其命名缘由将变得清晰明了。

在本短片中，我们将概述用于快速、低成本诊断结核病及耐多药结核病的mods检测方法。视频将逐步介绍该方法的操作流程。我们将讨论使用液体培养物时涉及的生物安全问题，同时解释实施该方法所需关注的一些重要质量保证事项。

MODS 检测法由秘鲁利马的卡亚纳大学 Bob Gilman 实验室开发。该方法基于最初由 Loose Cavi 观察到的现象。Loose 试图通过比色指示剂寻找快速检测培养物中结核分枝杆菌的方法。

但她指出，在显微镜下观察这些培养物时，可在比色指示剂变色前数天就观察到微生物的生长，MOD 的检测方法正是基于这一观察结果而开发的。MOD 检测法是在资源有限的条件下研发的，目标应用环境也是资源有限的地区，因此每项测试的成本略低于 3 美元，可用于基于液体培养的结核病检测及耐多药检测。该方法极具吸引力，首次将此类诊断能力带入了资源有限的地区。

因此，MODS检测基于三个核心原理。第一，结核分枝杆菌在液体培养基中的生长速度远快于在固体培养基中的生长速度。这一事实已被认识多年。

其次，如果我们在显微镜下观察这些液体培养基，便能比等待固体培养基上菌落的宏观出现更快速地检测到结核分枝杆菌的生长。事实上，这种生长特征具有完全的特异性，使我们能够将液体培养基中的结核分枝杆菌与细菌或真菌污染，以及可能存在的非结核分枝杆菌（非典型分枝杆菌）的生长区分开来。最后，也是mods检测法最令人兴奋的一点是，我们可以在培养基中加入利福平这类药物，从而直接从痰标本中检测出耐多药性。

通过在实验开始时使用这些药物，我们能够同时检测结核病以及分离株对这两种药物是否耐药。这消除了进行传代培养并建立间接药物敏感性试验的需要。接下来，我们将简要介绍进行 MODS 实验所需的设备。

需要一个冰箱来储存制备好的培养基。需要天平来称量异烟肼和利福平。需要涡旋振荡器来混匀痰液样本。

使用去污染溶液时，需要通过离心来浓缩去污染后的痰液样本，离心机应能达到 3000 G。离心机无需制冷，但必须具备生物安全性能，且必须符合生物安全要求。进行分枝杆菌相关工作时，离心机的转子桶必须能够用可锁闭的盖子密封。需要一个能够升至并维持 37 摄氏度的培养箱。

此环境无需添加CO2。读取mods平板需要使用倒置显微镜，该显微镜应配备4×和10×物镜；需要高压灭菌器对培养基进行灭菌，以及处理微生物培养物废弃物；分装培养基需要使用微量移液器；操作痰液样本及平板接种等步骤需在二级生物安全柜中进行。

进行mods检测所需的试剂如下：Middlebrook 7H9培养基、吐温-80（Tween-80）、甘油、PANTA（抗生素补充剂）以及OADC（营养补充剂）。抗生素储备液包括异烟肼和利福平；二甲基亚砜（DMSO）用于配制利福平溶液；用于痰标本去污染的氢氧化钠、柠檬酸钠和N-乙酰半胱氨酸；用于配制磷酸盐缓冲液的磷酸氢二钠和磷酸二氢钾；10%次氯酸钠用于感染性废弃物的处理；以及用于工作台面清洁的消毒剂。此外还需以下塑料制品和耗材：无菌玻璃试管、用于水相溶剂的0.2微米滤器和用于有机溶剂的0.2微米滤器、微量离心管、15毫升离心管、无菌50毫升和10毫升血清移液管、移液器吸头、24孔组织培养板，以及可密封的Ziploc类型塑料袋——接种痰标本至培养基后，24孔板需放置于此类塑料袋中。

可预先配制四种储备溶液。磷酸盐缓冲液由磷酸钠、二碱（diba）和磷酸二氢钾溶液混合而成，调节 pH 至 6.8 ± 0.2。该溶液在 121 至 124 摄氏度下高压灭菌 15 分钟以实现灭菌，并取部分样品接种于营养琼脂培养基上，以确认无菌状态。

该溶液可在 2 至 8 摄氏度的冰箱中保存长达一个月。每份痰液样本需要 10 毫升磷酸盐缓冲液。用于痰液去污染的储备溶液为氢氧化钠-柠檬酸钠混合液。

上述溶液等体积混合后，在121至124摄氏度下高压灭菌15分钟，也可在2至8摄氏度的冰箱中保存最多一个月。每份痰标本需要2毫升该溶液。基础培养基由Middlebrook 7H9加OADC和甘油组成。

将七号H九粉末溶解于含有甘油和卡斯酮的无菌蒸馏水中，并持续搅拌直至完全溶解。该培养基在121至124摄氏度下高压灭菌15分钟，冷却后分装至无菌的16 mm × 100 mm玻璃试管中，每管4.5毫升。培养基在37摄氏度下孵育48小时以验证无菌状态，若此时无浑浊现象即表明无菌。密封后可在2至8摄氏度保存一个月。

每个痰液样本需要一支含有 4.5 毫升该培养基的试管。培养基中抗生素储备液的配制方法如下：将抗生素完全溶解于无菌蒸馏水中，并使用 0.2 微米注射器滤器过滤（适用于水溶性溶剂）。随后可将 20 微升分装液储存于无菌微量离心管中，在零下 20 摄氏度条件下保存，最长可达六个月。每份 20 微升分装液足以用于最多 100 个样本。

将利福平溶解于DMSO和无菌蒸馏水中，配制成每毫升含8毫克的利福平储备液。该混合液使用0.2微米有机溶剂专用注射器滤器过滤，所得溶液可分装为20微升的等份，置于无菌微量离心管中，在零下20摄氏度保存，最长可达六个月。每份20微升溶液可用于多达100个样品。接下来，我们进入实验方法的具体部分，介绍操作当天需要进行的三个步骤。

这是将储备液转化为工作液的过程。首先是我们用于去污染的溶液，然后是培养基溶液。最后是药物异烟肼和利福平的工作液。

用于mods技术的去污染方法是标准化的氢氧化钠NALK去污染法。NALK是一种黏液溶解剂，有助于消化痰液，从而使氢氧化钠发挥去污染作用。为此，我们需要氢氧化钠柠檬酸钠储备液，并向20 ml该溶液中加入0.1克NA。

任何未在配制当天使用完毕的溶液均须丢弃。培养基的最终配制也必须仅在使用当天进行。将储存的7H9培养基与OADC和Panta混合，每支试管中加入4.5毫升培养基、0.5毫升OADC和0.1毫升Panta。

这足以用于一个样本。每种药物的工作溶液均在使用当天配制，未使用的溶液应丢弃，因为无法保证其活性。储存的等分试样需用培养基在24孔组织培养板中进行连续稀释，使加入痰液样本和培养基后，最终孔中的浓度为每毫升0.4微克对苯二甲酸和每毫升1微克利福平。

接下来进行去污染步骤，将2 mL痰液样本加入一个锥底Falcon管中，然后加入2 mL的氢氧化钠-氯化钠去污染溶液。盖上管盖并拧紧，随后涡旋混匀，静置15分钟，在此期间完成去污染过程。静置结束后，加入14 mL磷酸盐缓冲液。

盖上盖子并拧紧，将离心管在3000 G条件下离心50分钟后，倒出上清液S，留下的沉淀即为待用5.1毫升七H九OEDC panter管进行涂布的样品。将该沉淀重悬至约2毫升体积。将一半重悬后的样品作为备份，保存在微量离心管中。

这样，一旦我们的培养物受到污染，需要再次涂布样品时，就可以使用该保存的菌种。将另一毫升加入到玻璃管中剩余的七毫升 H9 培养基中，即得到我们用于涂布的待测样品。取该培养基与样品的混合悬液 900 微升，分别加入 24 孔板某一列的四个孔中。

24孔板中其余的孔加入后续样本，使每块24孔板包含五个样本，分别对应前五列，第六列不加样本作为空白对照。该第六列中仅加入所有培养基成分，但不加入痰液样本；若此列中出现任何生长，表明存在交叉污染问题，整块孔板必须弃用。

我们运行的每一块平板都需要设置一列阴性对照。现在，我们已准备好含有所有样品和培养基的平板，还需在另一块平板中加入抗生素悬液。

我们已按照先前所述方法制备了利福平和异烟肼的稀释液，使用多通道移液器从这些孔中各吸取100 µL，并向两个对照孔中各加入100 µL的7H9 OADC，向两个含药孔中分别加入100 µL利福平和100 µL异烟肼。完成加样后，盖上板盖并将其放入密封袋中。从此时起，该Ziploc袋不再打开，因此任何在液体培养基中生长的培养物均不会有机会离开该袋。

从现在开始，所有对培养板的读取均在袋内完成，培养结束后将袋子放入高压灭菌袋中丢弃。通过这种方式，我们避免了对高浓度分枝杆菌悬液的操作。接下来简要介绍质量控制。

mods 方法中包含内置的质量控制措施，这些措施对于正确使用该检测方法至关重要。首先，每次实验都必须设置阴性对照。如前所述，每块板上设有一列不含痰标本、仅含培养基成分的对照孔，同时板上还包含另外五个痰标本孔。这些对照孔应与其他孔一样进行观察，若在这些对照孔中出现任何生长迹象，则表明发生了交叉污染，因此该板上的所有结果均不可信。

因此必须弃去该板，并将所有样品重新接种。此外，还设有作为阳性对照的内部对照。这些对照需在另一块板上进行，该板在当天所有其他样品板制备完成后，于最后阶段制备，以最大限度降低实验室内的交叉污染风险。

在此独立的平板上，我们同时运行一株完全敏感的结核分枝杆菌以及一株对异烟肼和利福平耐药的菌株。如果对在平板上操作多重耐药菌株存在安全顾虑，可用仅对利福平耐药的单耐药菌株替代上述敏感菌株和耐多药菌株。设置这些菌株的目的是不仅证明培养基支持细菌生长——因此所有阳性对照在无药物的孔中均应有生长——而且验证我们所用药物浓度正确：敏感的阳性对照在含有异烟肼和利福平的孔中不应生长，而耐药的阳性对照则应在含有平板中设定浓度的利福平和异烟肼的条件下明显生长。

好的，现在开始进行平板读数。如果我们把接种样本的当天视为第0天，那么平板读数从第5天开始。在此之前，极少能观察到分枝杆菌的生长。

在倒置光学显微镜下观察培养板。也就是说，从培养板的下方向上观察，这样可以非常清晰地看到索状结构；而从上方观察培养物时，由于培养板盖上的冷凝水以及标准显微镜的焦距不足，观察会受到阻碍。显微镜检查通常使用10倍物镜进行，将药物-free孔中每孔至少含有两个菌落形成单位的培养视为阳性结果。

污染的存在很容易被识别，因为培养基会变得浑浊，且到第五天时，大多数孔内通常会出现过度生长。相比之下，分枝杆菌的生长不会导致孔内液体浑浊；分枝杆菌的初期生长表现为微小的逗点状结构，随后逐渐发展形成特征性的绳索状或缠结状结构。两周内，强阳性生长会形成分枝杆菌的聚集物，绳索状结构仅在边缘处清晰可见。

绝大多数培养物在第14天前会呈现阳性，因此我们建议从第5天至第14天每日观察读取结果，之后根据实验室当天的工作量每两到三天读取一次。当两个不含药物的孔中培养物明显呈阳性时，应立即读取含药物孔的结果。在任一药物存在下若出现生长，表明对该药物具有耐药性。非常重要的是，如果含药孔的读取时间比不含药孔中发现阳性培养物的时间晚超过一周，则此时的生长可能并不代表真正的耐药性，因为偶尔会出现突破性生长现象。

如果培养结果为阴性，可在第21天停止观察，因为在未接受治疗的患者中，从未出现过21天后培养转为阳性的病例。完成21天孵育后，可将培养物丢弃。培养物应保留在其自封袋（Ziploc bags）中，并放入高压灭菌袋内，在121至124摄氏度下高压灭菌45至60分钟，之后可安全丢弃。接下来，我将简要介绍生物安全以及MODS检测方法，因为我们不仅在秘鲁，也在非洲和亚洲的多个场所逐步推广MODS检测的应用。

关于在液体培养基中使用分枝杆菌培养物的安全性和生物安全性，人们经常提出疑问。这种担忧不无道理，因为液体确实可能发生溢洒，而固体培养基则不存在这一风险；此外，在处理分枝杆菌悬液时还存在气溶胶化的风险。然而，恰恰由于这些原因，我们认为mod方法学比任何需要间接药物敏感性试验的方法学更为安全。

其原因是，在进行间接药敏试验时，需要制备已知浓度的微生物悬液。因此，该过程涉及对高浓度微生物溶液的操作，存在溢出和气溶胶化的各种风险。相比之下，MODS方法（如您所见）仅需将痰标本接种到培养板中，随后将培养板密封于塑料袋内即可。

此袋此后不再打开，因此我们无需处理这些高浓度的悬液。这并不是说我们认为MOD方法完全安全，操作分枝杆菌始终存在风险。然而，韩国在2006年发表的数据似乎证实了我们的观点，即MOD方法并不比接种其他任何培养物更具危险性。

这是一项针对实验室工作人员开展的研究，结果表明，仅负责接种培养物且不承担药物敏感性试验工作的实验室人员，其职业暴露风险并不高于从事痰涂片显微镜检查的人员。相比之下，处理分枝杆菌悬液并进行药物敏感性试验的人员，其结核病职业暴露风险显著更高。显然，至关重要的是应尽可能全面保护所有实验室工作人员。因此，我们强烈建议，所有此类操作均不得在缺乏适当个人呼吸防护的情况下进行，此处所指的防护即佩戴符合N95标准的口罩。

此外，需要一个II级生物安全柜或通风橱，其所有排出区域均需通过高效微粒空气（HEPA）过滤器过滤。最后，一个在避免实验室内部气流紊乱方面非常重要的简单措施，是为实验室门安装门锁，以在样本处理过程中阻止人员进出。这可以降低实验室内部传播的风险。希望以上内容能让你对MODS方法学所包含的内容及其在资源有限但急需高质量结核病（TB）和耐多药结核病（MDR-TB）诊断的环境中可能具有的应用价值有一个全面的了解。

如需更多信息，您可以访问我们的网站 mods peru. org，您将找到我们详细的标准化操作程序（SOP）以及 mods 的用户指南。除了肺外样本处理的标准化操作程序外，我们还提供分枝杆菌和结核分枝杆菌、其他分枝杆菌以及细菌和真菌污染的图片库。此外，您还可以查阅我们的质量保证策略，以及我们推荐的实验室认证程序，以启动使用 mods 系统。

最后，我们提供了一份常见问题解答表，并欢迎正在使用这些模块的用户提出任何反馈意见，因为这是一种迭代式的方法。正如我们之前所解释的，这是一项非专有的检测方法，我们始终关注其他实验室所实现的任何改进。