Name: MODS的方法和诊断结核病耐药结核病 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 23 min 6 s
Description: 学习显微镜观察药敏试验（MODS）方法，用于快速、低成本诊断结核病和耐多药结核病。本视频详细讲解液体培养技术的操作步骤、生物安全要求及质量控制措施，适用于资源有限地区的高性能检测需求。

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我们感谢 Sean Fitzwater 和 Carmen Giannina Luna Colombo 提供结核病生长延时视频片段。&nbsp; 感谢 Marty Roper 在编辑和共同撰写用户指南过程中提供的全面而出色的反馈意见，本实验方案主要直接取自该用户指南。&nbsp; 本视频的制作由美国国立卫生研究院（NIH）/福格蒂国际中心（Fogarty International Center）资助，网址为 <a href="http://www.fic.nih.gov/">http://www.fic.nih.gov/</a>。David A.J. Moore 以惠康信托（Wellcome Trust）热带医学临床研究员及伦敦帝国理工学院传染病学 Reader 的身份做出贡献（资助编号：078067/Z/05）。&nbsp; Mark F. Brady 以 NIH/福格蒂国际中心研究学者的身份做出贡献。

<ol>
<li>配制储备液 <ol>
<li>磷酸盐缓冲液储备液 <ol>
<li>将950 ml 磷酸氢二钠溶液（9.47 g 磷酸氢二钠溶于1000 ml 蒸馏水中）与950 ml 磷酸二氢钾溶液（9.07 g 磷酸二氢钾溶于1000 ml 蒸馏水中）混合，搅拌；每种溶液各保留50 ml，以备必要时用于调节pH </li>
<li>调节pH至6.8 ± 0.2：加入磷酸氢二钠溶液以提高pH；加入磷酸二氢钾溶液以降低pH </li>
<li>在121–124°C下高压灭菌15分钟以达到灭菌效果 </li>
<li>在培养皿中的营养琼脂培养基上接种100μl磷酸盐缓冲液样品，于37°C培养48小时，以确认无菌性 </li>
<li>2-8°C 冰箱中保存，可存放长达一个月 注意每个痰液样本需要10 ml磷酸盐缓冲液 </li>
</ol></li>
<li>去污储备液 <ol>
<li>将等体积的氢氧化钠溶液（8.0 g 氢氧化钠溶于 200 ml 无菌蒸馏水）与柠檬酸钠溶液（5.8 g 柠檬酸钠溶于 200 ml 无菌蒸馏水）混合 </li>
<li>混合并在121–124°C下高压灭菌15分钟 </li>
<li>2-8°C 冰箱中保存，可存放长达一个月 注意每个痰液样本需要 2ml 去污染储备液 </li>
</ol></li>
<li>培养基储备液 <ol>
<li>向900 ml无菌蒸馏水中加入3.1 ml甘油、1.25 g酪蛋白胨和5.9 g 7H9培养基粉末；持续搅拌至完全溶解 </li>
<li>121–124°C 下高压灭菌 15 分钟 </li>
<li>将无菌培养基冷却后，分装至无菌的16×100 mm玻璃试管中，每管4.5 ml，用于样品制备；另分装每管10.8 ml，用于抗生素溶液和内对照的制备。 </li>
<li>37°C 下孵育 48 小时以验证无菌性（无浑浊） </li>
<li>2-8°C下避光保存，瓶盖需拧紧，可保存一个月 注意每个痰液样本需要一支含有4.5 ml 7H9培养基的试管 </li>
</ol></li>
<li>抗生素储备液 <ol>
<li>A. 异烟肼储备液（8 mg/ml） <ol>
<li>将20 mg异烟肼完全溶解于2.5 ml无菌蒸馏水中 </li>
<li>使用0.2 μm针头滤器过滤水相溶剂 </li>
<li>置于无菌微量离心管中，每管20μl，于-20°C保存，可存放长达6个月 注意：每个储存的20μl等分试样足以用于多达100个样品（包括损耗） </li>
</ol></li>
<li>B. 利福平储备液（8 mg/ml） </li>
</ol><ol>
<li>将20 mg利福平完全溶解于1.25 ml DMSO中 </li>
<li>加入1.25 ml无菌蒸馏水并混匀 </li>
<li>使用有机溶剂专用的0.2 μm注射器滤器过滤 </li>
<li>在无菌微量离心管中以20μl分装，于-20°C保存，可稳定存放长达6个月 注意：每个储存的20μl等分试样足以用于多达100个样品（包括损耗） </li>
</ol></li>
</ol></li>
<li>配制工作液 <ol>
<li>去污工作液 <ol>
<li>每20 ml所需去污溶液中溶解0.1 g NALC晶体 注意每个样本需要 2ml 去污溶液 注意：将未使用的 NaOH-NALC 去污染溶液在 24 小时后弃置，因为 NALC 的黏液溶解活性会随时间下降 </li>
</ol></li>
<li>培养基工作液 <ol>
<li>设置： <ol>
<li>每个痰样本处理所需的一管7H9培养基，以及每块平板额外增加的一管（用于阴性对照孔） </li>
<li>用于阳性对照的2管7H9培养基（若使用单耐药菌株则为3管） </li>
<li>用于抗生素溶液配制的1-2管含10.8 ml 7H9培养基的试管 </li>
</ol></li>
<li>向每个样品管中的4.5 ml 7H9培养基加入0.5 ml OADC </li>
<li>向含有10.8 ml 7H9的试管中加入1.2 ml OADC </li>
<li>留出2管含5 ml 7H9-OADC的试管用于阳性对照，另准备1管或多管含12 ml 7H9-OADC的试管用于抗生素溶液配制（这些试管无需添加PANTA）</li>
<li>重悬PANTA，并向每个样本管及阴性对照管中加入0.1 ml（7H9-OADC-PANTA：总体积=5.1 ml） 注意含PANTA的完全培养基7H9-OADC-PANTA用于痰液样本和阴性对照；阳性对照及抗生素溶液配制使用不含PANTA的7H9-OADC </li>
</ol></li>
<li>抗生素工作溶液 <ol>
<li>1. 在未使用的24孔板中配制抗生素工作液的步骤见图1 注意: 准确的药敏结果取决于最终的抗生素浓度。以下步骤适用于配备微量移液器的实验室。若无微量移液器，可使用结核菌素注射器，并采用 modsperu.org 网站用户指南附录3中所述的不同稀释系列。 注意: 不要重新冷冻或重复使用抗生素工作液或储存液，以免药物活性丧失。 在处理当天结束时丢弃所有未使用的抗生素溶液 图1. 制备抗生素工作溶液（来自 modsperu.org 用户指南） </li>
</ol></li>
</ol></li>
<li>痰液样本与平板制备<ol>
<li>去污<ol>
<li>将2 ml痰液样本加入15 ml离心管中（若不足2 ml，用磷酸盐缓冲液补足至2 ml；若超过2 ml，仅取2 ml使用）</li>
<li>加入2 ml NaOH-NALC溶液</li>
<li>盖紧管盖，涡旋振荡20秒；倒置试管，确保NaOH-NALC溶液接触试管内壁及管盖的整个内表面 </li>
<li>静置至少15分钟——若样品黏度较高，可适当延长几分钟。为避免过度处理， 不应超过20分钟</li>
<li>用磷酸缓冲液（pH 6.8）将试管补至14 ml，以中和碱性并终止去污过程，轻轻翻转试管4次充分混匀</li>
<li>在3000 g下离心15分钟（有关达到3000 g所需的每分钟转数计算公式，请参见modsperu.org用户指南中的附录2）</li>
<li>小心地将上清液倒入含有10%次氯酸钠或其他合适消毒剂的液体废液容器中，并保留沉淀物</li>
</ol></li>
<li>最终样品悬液的制备与备份<ol>
<li>使用含 5.1 ml 的 7H9-OADC-PANTA 培养基，用巴斯德吸管将离心管中的样品沉淀重悬于总体积为 2 ml 的培养基中，充分混匀</li>
<li>移取1 ml样品悬液，置于微量离心管中，于2–8°C保存作为备份</li>
<li>将第二份1 ml样品悬液加入含有剩余7H9-OADC-PANTA的离心管中，充分混匀。此即为可用于涂布的最终样品溶液。</li>
</ol></li>
<li>将样品悬液加入24孔板<ol>
<li>将900μl最终样品悬液分别加入24孔板中一列的4个孔内</li>
<li>用额外的样本重复上述步骤，直至除第3列外的所有列均被填满（或所有样本均完成点样）</li>
<li>加入900μl 7H9-OADC培养基 无样本 每个样本板第3列的4个孔中（阴性内对照）</li>
</ol></li>
<li>向样品中添加抗生素<ol>
<li>使用多通道移液器，小心吸取7H9-OADC和抗生素工作溶液（抗生素稀释板第2列——见图1）中的液体，将4个吸头各填充100μl。</li>
<li>将100μl等分试样加入含900μl样品溶液的第1列孔中 不接触培养板或样品</li>
<li>重复上述步骤，直至所有孔均加入额外的100μl培养基（无药物孔）或抗生素溶液（包括作为阴性对照的第3列）</li>
<li>用盖子盖好培养板，放入可密封的聚乙烯（Ziplock）袋中并封口从此时起，袋子不再被打开)</li>
<li>在37°C（CO₂）条件下孵育2 富集不是必需的</li>
</ol></li>
</ol></li>
<li>&nbsp;质量控制 <ol>
<li>每次实验均在每块板上设置阴性对照。&nbsp; 阴性对照列中任意孔出现任何生长迹象均表明存在交叉污染，因此必须弃用整块板，并对样本重新接种。 </li>
<li>阳性对照在当天结束前于单独的培养板上进行.&nbsp; 一列中运行一种完全药物敏感菌株，另一列中运行一种对异烟肼和利福平耐药的菌株。&nbsp; 如果对使用耐多药（MDR）菌株存在顾虑，可用异烟肼（INH）单耐药菌株和利福平（RIF）单耐药菌株分别替代敏感菌株和MDR菌株进行实验。&nbsp; 所有阳性对照在无药物的孔中均应有生长，以证明培养基支持微生物生长。&nbsp; 为验证药物浓度的准确性，敏感菌株不应在异烟肼（INH）或利福平（RIF）孔中生长，而耐多药（MDR）菌株则应在INH和RIF孔中均能生长。 </li>
</ol></li>
<li>酶标仪读数 <ol>
<li>以铺板当天为“第0天”，从第5天开始读板；若第5天结果为阴性，则每天（或根据工作量隔天）读板一次，持续至第14天，随后在第15至21天期间每2-3天读板一次。&nbsp; 使用10倍物镜在倒置光学显微镜下观察培养板 </li>
<li>A 阳性培养 是指存在两个或更多个菌落形成单位（&gt;2 CFU）在不含药物的两个孔中。&nbsp; 早期分枝杆菌生长形态呈小型弯曲的逗号状或螺旋状（第5-9天）。&nbsp; 菌落形成通常会发展为“索状”或“缠结状”结构（参见 modsperu.org 的图像库） </li>
<li>在培养物于两个无药孔中呈阳性当天，应读取含药孔的结果。&nbsp; 药物存在下出现任何生长均表明对该药物具有耐药性。 注意：如果对含药物的孔进行读数 &gt;在无药物孔中观察到阳性培养1周后，此现象可能并不代表耐药性，因为偶尔会出现突破性生长 </li>
<li>在第21天未呈阳性的样本被视为阴性培养物 </li>
<li>孔内出现浑浊是由于污染菌过度生长所致，而分枝杆菌的生长不会引起浑浊 </li>
<li>完成21天培养后，可弃置培养物。&nbsp; 培养物保持在密封袋中，放入高压灭菌袋后，在121-124°C下高压灭菌45-60分钟 </li>
</ol></li>
</ol>
&nbsp;

<ol><li>Arias, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+evaluation+of+the+microscopic-observation+drug-susceptibility+assay+for+detection+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Clinical evaluation of the microscopic-observation drug-susceptibility assay for detection of tuberculosis.</a> Clin Infect Dis. 44, 674-674 (2007).</li>
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<li>Tovar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+diagnosis+of+pleural+tuberculosis+using+the+microscopic-+observation+drug-susceptibility+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Improved diagnosis of pleural tuberculosis using the microscopic- observation drug-susceptibility technique.</a> Clin Infect Dis. 46, 909-909 (2008).</li>
<li>Vargas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+sputum-scarce+HIV-associated+pulmonary+tuberculosis+in+Lima%2C+Peru%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of sputum-scarce HIV-associated pulmonary tuberculosis in Lima, Peru.</a> Lancet. 365, 150-150 (2005).</li>
</ol>

MODS 检测主要针对资源有限的环境。&nbsp; 这是首次将结核分枝杆菌及耐多药结核分枝杆菌的快速液体培养检测能力引入资源有限地区，每个检测的成本不足 3 美元。&nbsp; MODS 是一种非专有的、可迭代的方法，MODS 社区始终关注其他实验室所实现的改进。
人们普遍关注结核病液体培养基培养的生物安全性，因为液体可能发生溢出或形成气溶胶。&nbsp; 我们认为，与所有涉及间接药物敏感性试验的方法相比，MODS 检测具有更高的生物安全性，因为间接药物敏感性试验需要操作高浓度的分枝杆菌溶液，存在溢出和气溶胶产生的相关风险；而 MODS 仅需将痰标本接种到培养板中，随后将培养板密封于塑料袋内，此后不再打开。&nbsp; 韩国的数据（Kim 2007）支持这一观点，结果显示，仅进行痰标本接种但不进行药物敏感性试验的实验室工作人员，其职业暴露风险并不高于从事痰涂片显微镜检查的工作人员；相比之下，进行药物敏感性试验的人员患结核病的职业风险显著更高。
我们强烈建议，实验室工作人员在未采取适当防护措施的情况下，不得进行任何这些操作。...

<table><tbody><tr><td>冰箱/冷冻柜</td><td>设备</td><td></td><td></td><td>用于储存预配制的培养基和抗生素储备液</td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>设备</td><td></td><td></td><td>辅助痰液去污染</td></tr><tr><td>离心机</td><td>设备</td><td></td><td></td><td>用于痰液浓缩；可达到3000 g；d&amp;#8211;s无需制冷，但必须具备生物安全性能（桶可密封）</td></tr><tr><td>恒温培养箱（37°C）</td><td>设备</td><td></td><td></td><td>用于培养；无需CO₂富集环境</td></tr><tr><td>倒置光学显微镜</td><td>显微镜</td><td></td><td></td><td>用于读取MODS培养板</td></tr><tr><td>高压灭菌器</td><td>设备</td><td></td><td></td><td>用于灭菌培养基、PBS及使用过的培养板</td></tr><tr><td>天平</td><td>设备</td><td></td><td></td><td>用于称量异烟肼、利福平和NALC</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9培养基（Difco）</td><td>试剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0713-17-9</td><td>500克/瓶；培养基基础成分</td></tr><tr><td>酪蛋白胰酶消化物（Casitone）</td><td>试剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0259&amp;#8208;17&amp;#8208;9</td><td>500克/瓶；培养基基础成分</td></tr><tr><td>甘油（甘油）冻干品</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G&amp;#8208;33&amp;#8208;500</td><td>500毫升/瓶；培养基基础成分</td></tr><tr><td>PANTA（抗生素混合物，冻干，BD）</td><td>试剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>B4345114</td><td>6瓶/包；抗生素培养基补充剂</td></tr><tr><td>OADC（Middlebrook OADC营养补充剂，BD）</td><td>试剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>B11886</td><td>10 × 20毫升/包；营养培养基补充剂</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（Hibri-Max）</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-2650</td><td>100毫升/瓶；用于配制利福平储备液</td></tr><tr><td>抗生素储备液：异烟肼</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-3377</td><td>50克/瓶；直接药敏试验</td></tr><tr><td>抗生素储备液：利福平</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R-3501</td><td>1克/瓶；直接药敏试验</td></tr><tr><td>氢氧化钠（颗粒）</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>500克/瓶；用于痰液去污染</td></tr><tr><td>柠檬酸钠（三钠盐二水合物）</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-4641</td><td>500克/瓶；用于痰液去污染</td></tr><tr><td>N-乙酰-L-半胱氨酸</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-7250</td><td>50克/瓶；用于痰液去污染</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾晶体，KH₂PO₄</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>500克/瓶；用于痰液去污染</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠，无水，Na₂HPO₄</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876</td><td>500克/瓶；用于痰液去污染</td></tr><tr><td>次氯酸钠</td><td>试剂</td><td>家用漂白剂</td><td></td><td>用于处理污染性废弃物</td></tr><tr><td>15毫升离心管（聚丙烯，15毫升 Falcon 35&amp;#8208;2096）</td><td>耗材</td><td>Fisher Scientific</td><td>14&amp;#8208;959&amp;#8208;49B</td><td>500个/箱；用于痰液去污染和浓缩</td></tr><tr><td>24孔板（组织培养板，24孔，BD Falcon 35&amp;#8208;3047）</td><td>耗材</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1</td><td>50块/箱；用于培养和观察</td></tr><tr><td>可密封聚乙烯袋，6 × 6 &amp;#8220;（自封袋）</td><td>耗材</td><td></td><td></td><td>用于生物安全，容纳24孔板</td></tr><tr><td>带盖玻璃管（16 × 100毫米 和 18 × 145毫米）</td><td>耗材</td><td>VWR international</td><td>47729-583</td><td>500支/箱；用于储存分装的培养基</td></tr><tr><td>螺口微量离心管（1.5毫升）</td><td>耗材</td><td>Fisher Scientific</td><td>05&amp;#8208;669&amp;#8208;22</td><td>1000个/箱；用于储存分装的抗生素储备液</td></tr><tr><td>0.22&amp;mu;m 滤膜（适用于水溶液）注射器滤器 Millex 蓝色</td><td>耗材</td><td>Fisher Scientific</td><td>SLGL 025 OS</td><td>50个/箱；用于过滤抗生素储备液</td></tr><tr><td>0.22&amp;mu;m 滤膜（适用于有机溶剂）注射器滤器 Millex 黄色</td><td>耗材</td><td>Fisher Scientific</td><td>SLGV 033 RS</td><td>50个/箱；用于过滤抗生素储备液</td></tr><tr><td>一次性巴斯德吸管，硼硅酸盐玻璃，9&amp;#8243;</td><td>耗材</td><td>Fisher Scientific</td><td>13&amp;#8208;678&amp;#8208;20C</td><td>720支/箱；用于混合PANTA与培养基混合液</td></tr><tr><td>气溶胶阻隔吸头，1000&amp;#8208;1300&amp;mu;l</td><td>耗材</td><td>Fisher Scientific</td><td>02&amp;#8208;707&amp;#8208;51</td><td>1000个/包；用于将培养基分配至培养板</td></tr><tr><td>USA Scientific 吸头 One 1&amp;#8208;200&amp;mu;l 黄色吸头</td><td>耗材</td><td>Fisher Scientific</td><td>1111&amp;#8208;0006</td><td>1000个/袋；用于稀释抗生素储备液</td></tr></tbody></table>

用于结核病及耐多药结核病诊断的mods方法

The MODS method for diagnosis of tuberculosis and multidrug resistant tuberculosis

活动性肺结核（TB）患者每年可传染10至15人，因此对活动性结核病的诊断对于治愈患者和防止新感染至关重要。此外，耐多药结核病（MDRTB）的出现意味着必须检测药物耐药性，以阻止耐药菌株的传播。显微观察药物敏感性（MODS）检测是一种低成本、低技术门槛但高性能的TB和MDRTB检测工具。MODS检测基于三个原理：1）结核分枝杆菌（MTB）在液体培养基中的生长速度快于固体培养基；2）与等待固体培养基上菌落的肉眼可见生长相比，可在液体培养基中更早通过显微镜观察到MTB的特征性生长，且该生长形态具有特异性，可将其与非典型分枝杆菌、真菌或细菌污染相区分；3）可将异烟肼和利福平两种药物加入MODS检测体系中，从而实现对MDRTB的同步直接检测，无需进行亚培养即可完成间接药物敏感性试验。目前现有的竞争性诊断方法存在诸多局限：痰涂片检测敏感性低；固体培养基培养诊断耗时长；现有液体培养方法成本过高；且检测MDRTB时需进行亚培养以完成间接药物敏感性试验。相比之下，非专利的MODS方法对TB和MDRTB具有高敏感性，是一种相对较快的培养方法，可同步提供MDRTB的药物敏感性检测结果，并且在资源有限的环境中每例TB和MDRTB检测成本不足3美元，具有良好的可及性。

显微镜观察药物敏感性（MODS）检测是一种低成本、低技术门槛的高效结核病（TB）及耐多药结核病（MDRTB）检测工具。本视频介绍了MODS液体培养基培养方法。

用于结核病及耐多药结核病诊断的MODS方法

活动性肺结核（TB）患者每年可传染10至15人，因此对活动性结核病的诊断对于治愈患者和控制传播均至关重要。

全球每三个人中就有一人感染结核病。诊断活动性结核病可防止新的感染，因为未经治疗或死亡前，每位活动性结核病患者每年可传染10至15人。MODS 是一个缩写词，我们用它来避免重复表述“显微镜观察药物敏感性检测”，随着方法学的解释，其命名原因将变得清晰明了。在本短片中，我们将概述用于快速、低成本诊断结核病及耐多药结核病的mods技术方法。视频将逐步展示该方法的操作流程。我们将讨论使用液体培养物时涉及的生物安全问题，同时也会解释实施该方法所需关注的一些重要质量保证事项。MODS 检测法由秘鲁利马的卡亚纳大学 Bob Gilman 实验室研发。该方法基于最初由 Loose Cavi 观察到的现象。Loose 试图利用比色指示剂寻找快速检测培养物中结核分枝杆菌的方法。但她指出，在显微镜下观察这些培养物时，可在比色指示剂变色前数天就观察到微生物的生长，MOD 的检测方法正是基于这一观察结果而开发的。MOD 检测法是在资源有限的条件下研发的，目标应用环境也是资源有限的地区，因此每项测试的成本略低于 3 美元，可用于基于液体培养的结核病检测及耐多药检测。该方法极具吸引力，首次将此类诊断能力带入了资源有限的地区。因此，MODS检测基于三个核心原理。第一，结核分枝杆菌在液体培养基中的生长速度远快于在固体培养基中的生长速度。这一事实已被认识多年。其次，如果我们在显微镜下观察这些液体培养基，就能比等待固体培养基上菌落的宏观出现更快速地检测到结核分枝杆菌的生长。事实上，这种生长特征非常典型，以至于我们能够将液体培养基中的结核分枝杆菌与细菌或真菌污染，甚至与可能存在的非结核分枝杆菌（非典型）的生长区分开来。最后，也是mods检测法最令人兴奋的一点：我们可以在培养基中加入利福平类药物，从而直接从痰标本中检测出耐多药性。通过在实验开始时使用这些药物，我们能够同时检测结核病以及分离株对这两种药物是否耐药。这消除了进行分步培养和建立间接药物敏感性试验的需要。接下来，我们将简要介绍进行 MODS 实验所需的设备。需要冰箱来储存制备好的培养基。需要天平来称量异烟肼和利福平。需要涡旋振荡器来混匀痰液。使用去污染溶液时，需要通过离心机浓缩去污染后的痰液样本，离心机应能达到 3000 G。离心机无需制冷，但必须具备生物安全性能，确保生物安全。进行分枝杆菌相关操作时，要求离心机的转桶可使用可锁盖密封。需要配备能够达到并维持 37 摄氏度的培养箱。此环境无需增加 CO2 浓度。读取 mods 平板需要使用倒置显微镜，该显微镜应配备 4 x 和 10 x 物镜，同时需要高压灭菌器对培养基进行灭菌以及处理微生物培养物废弃物。分装培养基需要使用微量移液器，操作涉及痰液样本处理和接种平板的步骤时，必须在二级生物安全柜中进行。进行mods检测所需的试剂如下：Middlebrook 7H9培养基、吐温-80（Tween-80）、甘油、PANTA（一种抗生素补充剂）以及OADC营养补充剂。抗生素储备液包括异烟肼和利福平，二甲基亚砜（DMSO）用于配制利福平溶液，还有用于痰标本去污染的氢氧化钠、柠檬酸钠和N-乙酰半胱氨酸，用于配制磷酸盐缓冲液的磷酸氢二钠和磷酸二氢钾，10%次氯酸钠用于感染性废弃物的处理，以及用于工作台面清洁的消毒剂。此外还需以下塑料制品和耗材：无菌玻璃试管、用于水相溶剂的0.2微米滤器和用于有机溶剂的0.2微米滤器、微量离心管、15毫升离心管、无菌50毫升和10毫升移液管、移液器吸头、24孔组织培养板，以及可密封的类似Ziploc的塑料袋，接种痰标本至培养基后的24孔板需放置于该塑料袋中。可预先配制四种储备溶液。磷酸盐缓冲液由磷酸钠、二碱（diba）和磷酸二氢钾溶液混合而成，调节pH至6.8±0.2。该溶液在121至124摄氏度下高压灭菌15分钟以实现灭菌，并取部分样品接种于营养琼脂培养基上，以确认无菌状态。该溶液可在 2 至 8 摄氏度的冰箱中保存长达一个月。每份痰液样本需要 10 毫升磷酸盐缓冲液。用于痰液去污染的储备溶液为氢氧化钠-柠檬酸钠混合液。将上述溶液等体积混合，在121至124摄氏度下高压灭菌15分钟，也可在2至8摄氏度的冰箱中保存最多一个月。每个痰标本需要2 mL该溶液。基础培养基由Middlebrook 7H9培养基加Cascione和甘油组成。将七号H九粉末溶解于含有甘油和卡斯酮的无菌蒸馏水中，并持续搅拌直至完全溶解。该培养基在121至124摄氏度下高压灭菌15分钟，冷却后分装至无菌的16 mm × 100 mm玻璃试管中，每管4.5毫升。培养基在37摄氏度下孵育48小时以验证无菌状态，若此时无浑浊现象即表明无菌。密封管盖后，可在2至8摄氏度保存最多一个月。每份痰液样本需要一支含有 4.5 毫升该培养基的试管。培养基抗生素储备液的配制方法如下：将抗生素完全溶解于无菌蒸馏水中，并使用 0.2 微米注射器滤器过滤水溶剂。随后可将 20 微升分装液储存于无菌微量离心管中，在零下 20 摄氏度条件下保存长达六个月。每份 20 微升分装液足以用于多达 100 份样本。将利福平溶解于DMSO和无菌蒸馏水中，配制成每毫升含8毫克的利福平储备液。该混合液使用0.2微米有机溶剂专用注射器滤器过滤，所得溶液可分装为20 µL等份，置于无菌微量离心管中，在-20 °C保存，最长可达六个月。每份20 µL溶液可用于多达100个样品。接下来，我们进入实验方法的具体步骤，即操作当天需要完成的三个步骤。这是将储备液转化为工作液的过程。首先是我们用于去污染的溶液，然后是培养基溶液。最后是药物异烟肼和利福平的工作溶液。用于mods方法的去污染方法是标准化的氢氧化钠NALK去污染法。NALK是一种黏液溶解剂，有助于消化痰液，从而使氢氧化钠发挥去污染作用。为此，我们需要氢氧化钠柠檬酸钠储备液，并向20 ml该溶液中加入0.1克NA。任何未在配制当天使用完毕的溶液均须丢弃。培养基的最终配制也必须仅在使用当天进行。将储存的7H9培养基与OADC和Panta混合，每支试管中加入4.5毫升培养基、0.5毫升OADC和0.1毫升Panta。此剂量适用于一个样本。每种药物的工作液均在使用当天配制，未使用的溶液应丢弃，因为储存后的分装液活性无法保证。将分装液用培养基在24孔组织培养板中进行系列稀释，使得在加入痰液样本和培养基后，最终孔中的浓度为每毫升0.4微克的对羟基苯甲酸（foric acid）和每毫升1微克的利福平（Rifampin）。接下来进行去污染步骤，将2 mL痰液样本加入一个锥底Falcon管中，然后加入2 mL的氢氧化钠-氯化钠去污染溶液。盖上管盖并拧紧，随后涡旋混匀，静置15分钟，在此期间完成去污染过程。之后，加入14 mL磷酸盐缓冲液。盖上盖子并拧紧，将离心管在3000 G条件下离心50分钟后，倒出上清液S，留下的沉淀即为待用5.1毫升七H九OEDC panter管进行涂布的样品。将该沉淀重悬至约2毫升体积。将一半重悬后的样品作为备份储存在微量离心管中。这样，如果我们的培养物被污染，需要再次涂布样品时，就可以使用保存的菌种。另外1毫升则加入到玻璃管中剩余的7毫升H9OH A DC培养基中，此即为准备用于涂布的样品。取该培养基与样品的混合悬液900微升，分别加入24孔板一列中的四个孔内。24孔板中其余的孔加入后续样本，使每块24孔板包含五个样本，分别对应五列，第六列不加样本作为空白对照。该第六列中仅加入所有培养基成分，但不加入痰液样本；若此列中出现任何生长迹象，表明存在交叉污染问题，整块板必须弃用。我们运行的每一块平板都需要设置一列阴性对照。现在，我们已准备好含有所有样品和培养基的平板，还需在另一块平板中加入抗生素悬液。我们已按照先前所述方法制备了利福平和异烟肼的稀释液，并使用多通道移液器从每个孔中吸取100 µL，向两个对照孔中各加入100 µL的7H9 OADC培养基，向两个含药孔中分别加入100 µL利福平和100 µL异烟肼。待完成整个板的加样后，盖上板盖并将其放入一个密封袋中。从此时起，该密封袋不再打开，因此任何在液体培养基中生长的培养物均不会有机会离开密封袋。从现在开始，所有对培养板的读取均在袋内完成，培养结束后将袋子放入高压灭菌袋中丢弃。通过这种方式，我们避免了对高浓度分枝杆菌悬液的操作。接下来简要介绍质量控制。mods 方法中包含内置的质量控制措施，这些措施对于正确使用该检测方法至关重要。首先，每次实验都必须设置阴性对照。如前所述，每块板上设有一列不含痰标本、仅含培养基成分的孔，以及另外五个痰标本孔。该列中的孔应与其他孔一样进行观察，若这些孔中出现任何生长，表明发生了交叉污染，因此该板上的所有结果均不可信。因此必须弃去该板，所有样本均需重新包被。此外，还设有作为阳性对照的内部对照。内部对照需在另一块板上进行检测，该板在当天所有其他样本板制备完成后，于最后阶段制备，以最大限度降低实验室内的交叉污染风险。在此独立的平板上，我们同时运行一株完全敏感的结核分枝杆菌和一株对异烟肼和利福平耐药的菌株。如果对在平板上操作多重耐药菌株存在安全顾虑，可用仅对利福平耐药的菌株替代上述两株菌（即敏感菌株和多重耐药菌株）。这些菌株的作用不仅在于证明培养基支持细菌生长——因此所有阳性对照在无药物的培养基中均应有生长——还在于验证我们所用药物浓度是否准确：敏感的阳性对照在含有异烟肼和利福平的培养基中不应生长，而耐药的阳性对照则应在平板所含的利福平和异烟肼浓度下正常生长。好的，现在开始进行平板读数。如果我们把接种样本的当天视为第0天，那么平板读数从第5天开始。在此之前，极少能观察到分枝杆菌的生长。在倒置光学显微镜下观察培养板。也就是说，从培养板的下方向上观察，这样可以非常清晰地看到索状结构；而从上方观察培养物时，由于培养板盖上有冷凝水，且标准显微镜的焦距不够，观察会受到阻碍。显微镜检查通常使用10倍物镜进行，将药物-free孔中每孔至少含有两个菌落形成单位的培养视为阳性结果。污染的存在很容易被识别，因为培养基会变得浑浊，到第五天时，大多数孔内通常会出现过度生长。相比之下，分枝杆菌的生长不会导致孔内出现浑浊；分枝杆菌的初期生长形成微小的逗点状结构，随后逐渐发展成特征性的绳索状或缠结状结构。两周内，强阳性生长会形成分枝杆菌的聚集物，绳索状结构仅在边缘处明显可见。绝大多数培养物在第14天内会呈现阳性，因此我们建议从第5天到第14天每天观察读取结果，之后根据实验室当天的工作量每两到三天读取一次。当两个无药对照孔中培养物明显呈阳性时，应立即读取含药孔的结果。在任一药物存在下若出现生长，即表明对该药物耐药。非常重要的是，如果含药孔的读取时间是在无药孔中发现阳性培养物超过一周之后进行的，则此时观察到的生长可能并不代表真正的耐药，因为偶尔会出现突破性生长现象。如果培养结果为阴性，可在第21天停止观察，因为在未接受治疗的患者中，从未出现过21天后培养转为阳性的病例。完成21天孵育后，可将培养物丢弃。培养物应保留在其自封袋（Ziploc袋）中，放入高压灭菌袋，并在121至124摄氏度下高压灭菌45至60分钟，之后可安全丢弃。接下来，我将简要介绍生物安全以及MODS检测方法，因为我们不仅在秘鲁，也在非洲和亚洲的多个场所逐步推广MODS检测的应用。关于在液体培养基中使用微生物培养物的安全性和生物安全性，人们经常提出疑问。这种担忧不无道理，因为液体确实可能发生溢出，而固体培养基则不存在此类风险；此外，在处理分枝杆菌悬液时，还存在气溶胶化的风险。然而，恰恰由于这些原因，我们认为，与任何需要间接药物敏感性试验的方法相比，mod方法学实际上是一种更安全的检测方法。其原因是，在进行间接药敏试验时，需要制备已知浓度的微生物悬液。因此，该过程涉及对高浓度微生物溶液的操作，存在溢出和气溶胶化的各种风险。相比之下，正如您现在所了解的，MODS 方法仅需将痰标本接种到培养板中，随后将培养板密封于塑料袋内即可。此袋一旦封存便不再打开，因此我们无需处理这些高浓度的悬液。这并不是说我们认为MOD方法完全安全，操作分枝杆菌始终存在风险。然而，韩国于2006年发表的数据似乎证实了我们的观点，即MOD方法的危险性并不高于接种其他任何培养物。这是一项针对实验室工作人员开展的研究，结果表明，仅负责接种培养物且不承担药物敏感性试验工作的实验室人员，其职业暴露风险并不高于从事痰涂片显微镜检查的人员。相比之下，那些处理分枝杆菌悬液并进行药物敏感性试验的人员，其结核病职业暴露风险显著更高。显然，最大限度地保护所有实验室工作人员至关重要，因此我们强烈建议，所有上述操作均不得在缺乏适当个人呼吸防护的情况下进行，此处所指的防护即为符合N95标准的口罩。此外，需要一个II级生物安全柜或通风橱，其所有排出的空气均需通过高效微粒空气（HEPA）过滤器过滤。最后，一个在避免实验室内部气流紊乱方面非常重要的简单措施，是为实验室门安装门锁，以在样本处理过程中阻止人员进出。这可以降低实验室内部传播的风险。希望以上内容能为您清晰概述MODS方法学所包含的内容，以及其在资源有限但急需高质量结核病（TB）和耐多药结核病（MDR-TB）诊断的环境中可能具备的重要应用价值。如需更多信息，您可以访问我们的网站 mods peru. org，您将在该网站找到我们详细的标准化操作程序，以及 mods 的用户指南。除了肺外样本处理的标准化操作程序外，我们还提供了结核分枝杆菌、其他分枝杆菌以及细菌和真菌污染的图片库。此外，您还可以查阅我们的质量保证策略，以及我们推荐的实验室认证流程，以启动使用 mods 技术。最后，我们提供了一份常见问题解答表，并欢迎目前正在使用这些模块的用户提出任何反馈意见，因为这是一种迭代式的方法。正如我们之前所解释的，该检测方法不具有专属性，我们始终关注其他实验室所实现的任何改进。

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MODS的方法和诊断结核病耐药结核病

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用于结核病及耐多药结核病诊断的MODS方法

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