Name: 口腔感染杆状病毒鳞翅目幼虫的协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-03T23:29:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 了解杆状病毒口服感染鳞翅目幼虫的技术方法，包括液滴饲喂法和饲料块生物测定法。该方案用于评估病毒的杀虫效果并确定致死剂量，为农业害虫生物防治提供可靠的实验基础。

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请访问 <a href="http://www.springerprotocols.com/Abstract/doi/10.1007/978-1-59745-457-5_18">Springer Protocols</a> 以了解更多关于将杆状病毒改造为昆虫病原剂以及本实验所用口服感染技术的信息。

作者无任何利益冲突需要披露。

鳞翅目幼虫口服感染杆状病毒的实验方案

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

杆状病毒被广泛用作蛋白质表达载体以及昆虫害虫控制剂。本视频展示了如何通过滴喂法和饲料块法生物测定使鳞翅目幼虫感染多角体病毒。随附的Springer Protocols部分内容概述了杆状病毒的生命周期及其作为杀虫剂的应用，包括讨论将杆状病毒用作杀虫剂的优缺点，以及在通过基因改造提升杆状病毒杀虫效果方面取得的进展。

在本视频中，我们展示了利用杆状病毒对鳞翅目幼虫进行口服感染的技术，以测定其杀虫效率。

杆状病毒被广泛用作蛋白质表达载体以及昆虫害虫的防治制剂。本视频展示了如何利用鳞翅目幼虫进行……

杆状病毒（Baculovirus）通常被用作DNA载体，与昆虫细胞系联合用于蛋白表达。然而，这种病毒能够高效感染昆虫并导致其死亡的特性，也使其成为一种有效的杀虫剂。例如在巴西，每年将野生型杆状病毒应用于超过100万公顷的大豆作物，以防控豆毛虫。为了增强其杀虫效果，已对杆状病毒进行基因工程改造，插入编码昆虫特异性毒素的基因，这些毒素可在昆虫的血淋巴中发挥作用。在本视频中，我们演示了通过口服途径感染鳞翅目幼虫以分析杆状病毒杀虫效果的方法。大家好，我来自爱荷华州立大学眼科系的Blind Boning实验室，这位是同样来自Boning实验室的Wendy Sparks。今天我们将向您展示两种用于Lter幼虫感染VA病毒的实验方法。首先，Harran 将向您展示如何通过液滴饲喂生物测定法感染新生幼虫。然后，我将向您展示如何通过饲料血液生物测定法感染中期至晚期幼虫。那么，让我们开始吧。液滴饲喂生物测定可用于测定阿巴卡韦的致死剂量以及感染巴洛病毒幼虫的存活时间。该实验通常使用早期龄期或新生幼虫。开始之前，请确保已准备好装有合适饲料的饲喂杯。同时，配制含有绿色食用染料的病毒稀释液，使染料体积浓度达到4%。为了确定致死性病毒浓度，所配制的稀释液应能使死亡率介于1%至99%之间。可能需要先进行初步的生物测定，以确定合适的病毒浓度范围。在涡旋振荡试管以防止包涵体沉降后，将病毒溶液在60毫米的培养皿中滴加成两个同心圆的小液滴。对于所使用的每种病毒浓度，均需设置阴性对照组的模拟感染。下一步处理时，使用无菌画笔将25至30只新生幼虫转移至同心圆的中央。盖上培养皿盖，并用对二氯苯密封，以防止幼虫逃逸。理想情况下，应使用不同的画笔分别将每种病毒类型转移，以防止不同处理之间的交叉污染。将培养皿在室温下静置10至15分钟，期间幼虫会摄食。摄食后的幼虫可通过前肠呈现绿色来识别，这是由于绿色食用染料的转移所致；仅将已摄食的幼虫转移至含有饲料的一盎司塑料杯中，每杯转移一只幼虫。转移幼虫后，用盖子盖好培养杯，并在感染后于28摄氏度下培养24小时。清除含有死亡幼虫的培养杯，这些早期死亡很可能是由于操作过程中的损伤所致。使用该生物测定法确定致死剂量时，应每隔两到三天检查一次幼虫，直至模拟感染组幼虫以及任何存活的病毒处理组幼虫化蛹或开始钻入培养基准备化蛹；而病毒感染的幼虫将停留在食物表面，并在数天后死亡。死亡的幼虫有时会收缩并变黑，因感染而死亡的幼虫实质上会成为多面体包涵体的“囊袋”，这些包涵体会完全溶解。此时若受到机械扰动，应记录各处理组的幼虫死亡率。致死浓度生物测定应在不同时间重复进行三到四次。每种病毒或对照处理每个剂量组使用30个个体。使用适当的概率分析程序（如Polo或SAS）计算LC50值、95%置信区间及相关统计参数。该液滴饲喂实验也可用于测定ST 50生存时间值。在此情况下，每隔四到八小时对幼虫死亡率进行评分，并进行更频繁的观察。若死亡率较高，则使用病毒的LC 99剂量进行生存时间生物测定，利用S-PLUS或SAS程序通过Kaplan-Meier估计法计算中位生存时间及95%置信区间。现在，哈朗已经向您展示了液滴饲喂生物测定法，接下来我将为您介绍食料塞生物测定法。在食料塞生物测定法中，使用含有已知剂量病毒的食料塞饲喂中期至晚期的幼虫，以确定其致死剂量（LD 50）。在进行该测定的前一天，需将幼虫从食料杯中取出，使其禁食过夜。此步骤将加快幼虫摄食病毒的速度。接种后的第二天将饲料切成约2立方毫米的小块。如果饲料块过小，会容易变干。如果饲料块过大，幼虫将无法在一夜之间摄食完整个饲料块。现在向每个饲料块中加入一到两微升的多面体悬浮液。该悬浮液含有体积分数为4%的食用色素染料。让悬浮液浸泡饲料5到15分钟。记得同时准备经模拟病毒处理的饲料块作为阴性对照。接下来，将一块饲料转移至每个杯中的四龄幼虫。然后将杯子置于28摄氏度培养箱中过夜。次日，丢弃未完全吃完饲料块的幼虫。随后向每杯中添加一大块饲料，供剩余的幼虫食用。将幼虫维持在28摄氏度环境中，根据需要补充饲料，直至模拟感染组幼虫和存活的病毒感染组幼虫进食完毕或开始化蛹。此时，记录死亡和存活昆虫的数量。我们将向您展示两种用杆状病毒感染昆虫的方法：血液接种法和取食活检法，以及饮食斑块活检法。进行此操作时，需注意被杆状病毒感染致死的虫体通常较为脆弱，容易破裂，从而释放出病毒。因此，请对工作台面进行灭菌，并妥善处理受污染的手套和一次性材料，以防止污染。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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口腔感染杆状病毒鳞翅目幼虫的协议

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了解杆状病毒口服感染鳞翅目幼虫的技术方法，包括液滴饲喂法和饲料块生物测定法。该方案用于评估病毒的杀虫效果并确定致死剂量，为农业害虫生物防治提供可靠的实验基础。

鳞翅目幼虫口服感染杆状病毒的实验方案

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