Microapplicator辅助鳞翅目幼虫与杆状病毒感染的协议
2008年8月23日
在这段视频中，我们展示了两个microapplicator用于鳞翅目幼虫与杆状病毒感染，以确定杀虫效率的技术。
虽然节肢动物特异性杆菌病毒被用作真核蛋白表达系统的标准研究工具，但它也被开发为一种环境安全的杀虫剂，可以杀死自然界中的食草昆虫，如鳞翅目。鳞翅目幼虫在食用受感染的叶子时会被 baccala 病毒感染。幼虫或毛虫以一种称为多面体的形式摄入巴卡拉病毒，多面体是一种包装在大结晶蛋白质结构中的病毒颗粒复合物，可保护病毒免于干燥。
一旦幼虫被感染，对接病毒就会在昆虫体内传播感染。病毒劫持了宿主的核酸和蛋白质合成机制，制造更多的病毒和多面体。最终，幼虫被病毒彻底感染，以至于它们溶解成一团凌乱的多面体渗出物，滴落在昆虫吃掉的植物表面，然后这个循环重新开始，以确定特定 Baca 的杀虫功效。
Avir 菌株微量施药器技术和生物测定法可以结合使用。Leid dorin 幼虫可以通过将对接病毒直接注射到 HemosIL 或体腔中来感染，并且可以评估死亡率。此外，可以使用口服微涂抹器辅助注射用多面体感染幼虫，并且可以测定肠道和其他组织感染的时间。
嗨，我是爱荷华州立大学昆虫学系 Brian e boning 实验室的 Wendy Sparks，我也来自 boning snap。今天，我们将向您展示用积压病毒感染实验室导管 DI 的两种程序。两种方法都使用微型涂抹器。
首先，我将向您展示如何使用微型涂抹器通过 prole 将身体病毒输送到 he 中。然后，当展示时，您使用微型涂抹器通过鼠标将 poly 标头输送到中护罩中。那么让我们开始吧。
当为杀虫目的而开发时，巴洛病毒通常含有多面体基因，以促进害虫幼虫的口腔感染。然而，有时有理由测试多面体阴性杆菌病毒的潜在杀虫作用或绕过昆虫的肠道。在这种情况下，在开始测定之前，可以使用微涂抹器注射对接病毒以感染幼虫。
应使用噬菌斑测定或终点稀释测定法测定对接病毒工作原液的滴度。对于生理实验，通常每 5 龄 H VNS 向第 4 个 PFU 注射 5 次 10 倍。要开始这种生物测定，请将每个对接的病毒稀释液装入带有 28.5 或 32 号锋利针尖的 1 cc 至 Hercule 注射器塑料中。
通常为 1 至 3 μL 对接病毒溶液。每只幼虫的滴度为 10 到 7，每毫升减 10 到 8 分之，因此将 300 至 500 微升装入注射器就足以满足大多数目的。接下来，将注射器直立，将空气引入针尖并分配，将气泡从注射器中排出。
然后将注射器固定在注射器支撑管上。现在将体积设置为 1.0 微升。对于微型涂抹器微处理器控制单元上的每个液滴，首先校准控制单元以确保分配正确的体积，液滴分配的速度可以设置为 0 到 9 的等级。
通常使用 0 到 1 的范围。按下脚踏开关以确保正确分配溶液。请记住，如果分配过多的溶液或应用速度太慢，则可以调整体积和速度设置，直到以正确的速率应用正确的溶液体积。
我现在准备开始注射 H VNS 感染。通常注射早期五龄幼虫，较大尺寸的晚龄幼虫有利于注射过程。将针尖穿过其中一个专业腿的平面并插入体腔。
注意，当针尖插入 prole 时，改变幼虫的身体位置 为避免损坏肠道和体壁，现在按下脚踏开关四次，将 4 微升病毒溶液输送到血液密封中。注射完成后，将所有幼虫放回 28 摄氏度的培养箱中。经常检查是否有死亡幼虫，并确保为存活的幼虫提供足够的饮食。
即使晚龄幼虫不会因注射引起的角质层损伤而死亡，但仍应在注射后 24 小时检查幼虫，以防细菌感染导致肠道损伤。这种早期死亡率应被排除在数据分析之外。如果使用带有对接病毒的微量涂抹器辅助生物测定进行致死浓度生物测定，则应在不同场合重复生物测定 3 或 4 次。
对于每种病毒或对照治疗，每剂使用 30 人。使用适当的遗嘱认证分析程序（如 polo 或 SAS）来计算 lc 50 值、95% 置信区间和适当的统计数据。该生物测定法还可用于确定接种固定剂量病毒后的 ST 50 存活时间值。
在这种情况下，每 4 到 8 小时对幼虫死亡率进行一次评分，并进行更频繁的观察。如果死亡率很高，则使用 s plus 或 SAS 程序的 Kaplan Meyer 估计器计算 95% 置信限中的中位生存时间。现在 Harran 已经向您展示了使用对接病毒的微涂抹器辅助生物测定。
我给你看一下检测方法。使用多面体 当感染的确切时间至关重要时，使用多面体直接口服接种到昆虫肠道中。例如，当监测病毒如何在昆虫内传播以开始此测定时，将多面体悬浮在 10 至 300 的甘油和水的中性浮力 3 比 2 溶液中。
例如，多面体可用于四龄 h ance。然后将此溶液装入带有 32 号钝头针头的塑料或玻璃 CC 结核菌素注射器中。将注射器放在微型涂抹器的支撑管上，俯视显微镜。
将第四或第五个握在星形幼虫中，将针头通过嘴插入中肠的前部区域，然后输送多面体。这种技术需要一些练习。首先，用手套握住幼虫而不压扁它可能很棘手。
其次，需要一些练习才能将针头穿过口器。我们建议您练习用 PBS 接种大约 30 只幼虫。如果你碰巧刺穿了肠道，那会很明显，因为幼虫黑化并很快变黑。
同样，由于微量涂抹器辅助口服接种提供了确切的感染时间，因此该方法对于感染时间对于确定病毒如何在昆虫内传播很重要的实验最有用。例如，表达 β 半乳糖 dase 的病毒可以口服接种到幼虫中，然后在不同的时间点解剖幼虫以确定哪些组织被感染，此时我们只向您展示两个用于感染的微型涂抹器辅助血管。昆虫爱与vir，其中第一个是通过对屁股病毒的 pro Legg 直接接种，这使您可以绕过肠道生理学并评估您感兴趣的病毒的致死率和致死时间。
第二种技术是使用多面体直接接种到中肠中。这使您可以将非常精确的剂量直接输送到中肠，并控制非常精确的事件时间。然后，您还可以研究病毒的死亡率和其他表型。
在进行此程序时，重要的是要记住，鲍拉病毒杀死的幼虫尸体通常很脆弱，很容易破裂释放病毒。因此，请对工作台面进行消毒，并以适当的方式处理受污染的手套和一次性材料，以防止污染。就是这样。
感谢您的观看。祝你的实验好运。
概述
本视频演示了两种用于感染鳞翅目幼虫的微型施用技术，以评估杀虫效率。这些方法包括直接注射碰底病毒和口服接种多面体。
关键研究组成部分
科学领域
- 昆虫学
- 病毒学
- 杀虫研究
背景
- 杆状病毒被用于真核蛋白表达研究。
- 它们正在被开发为环保型杀虫剂。
- 鳞翅目幼虫可以通过摄入受感染的叶子而被感染。
- 病毒可以导致幼虫溶解成多面体渗液，继续感染周期。
研究目的
- 展示用杆状病毒感染幼虫的方法。
- 评估不同杆状病毒毒株的杀虫效果。
- 提供评估幼虫死亡率的生物测定协议。
使用的方法
- 将碰底病毒注射到幼虫的体腔中。
- 将多面体口服接种到幼虫的肠道中。
- 使用微型施用器精确递送病毒溶液。
- 评估死亡率和感染时间。
主要结果
- 两种方法都有效地感染鳞翅目幼虫的杆状病毒。
- 注射法允许控制评估病毒效果。
- 口服接种提供了感染时间的洞察。
- 生物测定可以确定致死浓度和存活时间。
结论
- 微型施用技术对于研究杆状病毒感染有效。
- 这些方法可以帮助评估杆状病毒作为杀虫剂的潜力。
- 进一步的研究可以优化这些技术以用于各种应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Precise delivery of viral agents to insect models enables mechanistic de-risking of baculovirus-based biopesticides by isolating infection variables and quantifying dose-response relationships. This supports target validation in entomological pathways and predictive confidence in lethality assays prior to field deployment. The method aids in screening viral strains for insecticidal potency and informs go/no-go decisions in early-stage biologics development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by delivering controlled doses of baculovirus to bypass gut physiology and assess direct tissue effects.
- Operational Value: Supports functional target validation through standardized microapplicator-assisted injection of budded virus into the hemocoel.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by isolating infection timing and dissemination patterns for lethal phenotype assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by enabling oral inoculation of polyhedra into the midgut with precise temporal control.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through calibrated microapplicator delivery of defined virus titers (10⁷–10⁸ PFU/mL).
- Scalability Value: Highlights screening readiness via replication of bioassays three to four times with 30 individuals per dose for LC₅₀ determination.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Supports disease-relevant systems by enabling study of virus dissemination in tissues following gut-targeted or systemic infection.
- Preclinical Continuity: Connects discovery through preclinical validation by measuring mortality and survival time (ST₅₀) using Kaplan-Meier estimator.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs decisions on viral strain selection based on lethal concentration and survival time outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical efficacy testing by enabling quantitative infection modeling in lepidopteran hosts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by allowing precise delivery of virus to specific tissues (hemocoel or midgut) to isolate mechanisms of pathogenesis.
- Screening: Describes assay readiness through standardized microapplicator protocols for delivering polyhedra or budded virus with volume control (1.0 µL droplets) and speed settings (0–1 scale).
- Analytics: Highlights quantitative outputs such as mortality scoring every 4–8 hours, LC₅₀ calculation via Polo or SAS, and ST₅₀ estimation using Kaplan-Meier analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling time-resolved dissection of infected larvae to track tissue-specific infection dynamics.
- Enterprise Reuse: Frames the microapplicator as a reusable platform for standardized viral challenge across insecticidal R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in infection routes, and clarification of viral dissemination kinetics.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of viral delivery via microapplicator calibration and syringe-based dosing.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency in strain screening, and reduced late-stage biological risk in biopesticide development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of baculovirus strains based on quantified lethality and infection timing data.
Implementation Considerations
- Required expertise in entomological handling, microapplicator operation, and bioassay design.
- Instrumentation includes microapplicator with microprocessor control, syringe support tube, 28.5–32 gauge needles, and incubators at 28°C.
- Cross-team standardization requires consistent virus titer determination (plaque or endpoint dilution), volume calibration, and mortality scoring protocols.
- Adaptation considerations include larval instar selection (early fifth instar for injection, fourth/fifth for oral), gut integrity monitoring, and avoidance of bacterial contamination post-injection.
- Practical limitations include larval fragility post-infection, need for sterile disposal of cadavers, and exclusion of early mortality from injection trauma.
