Name: Sigma的非特异性蛋白酶活性测定 - 酪蛋白作为基质 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-17T09:14:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: 学习使用酪蛋白作为底物的比色法测定非特异性蛋白酶活性，通过释放酪氨酸生成蓝色显色产物，利用分光光度计定量检测，建立标准曲线计算酶活性单位，适用于实验室质量控制中蛋白酶制剂的活性验证与标准化检测。

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在开始实验之前，我们需要确保以下试剂已正确配制：
<ol>
<li>50 mM 磷酸钾缓冲液，pH 7.5。使用11.4 mg/ml的磷酸氢二钾三水合物溶于纯水中，并用1M HCl调节pH值。使用前将该溶液置于37°C环境中。</li>
<li>0.65% 质量/体积的酪蛋白溶液，通过将6.5 mg/ml酪蛋白加入50 mM磷酸钾缓冲液中制备。在温和搅拌下逐步升温至80–85 °C，持续约10分钟，直至形成均匀分散体系。切勿将溶液煮沸。如有必要，用NaOH或HCl调节pH值。</li>
<li>110 mM 三氯乙酸溶液，通过将6.1N的储备液用纯水按1:55稀释制备。三氯乙酸为强酸，操作时应小心谨慎。</li>
<li>0.5 mM Folin &amp; Ciocalteu's试剂（又称Folin酚试剂），该试剂将与酪氨酸反应产生可测量的颜色变化，颜色变化程度与蛋白酶活性直接相关。Folin酚试剂具有酸性，操作时应小心。</li>
<li>500 mM 碳酸钠溶液，使用53 mg/ml无水碳酸钠溶于纯水中制备。 酶稀释液，由10 mM醋酸钠缓冲液含5 mM醋酸钙组成，pH 7.5，预热至37°C。该溶液用于溶解固态蛋白酶样品或稀释酶溶液。</li>
<li>1.1 mM L-酪氨酸标准储备液。使用0.2 mg/ml L-酪氨酸溶于纯水中，轻轻加热至酪氨酸完全溶解。与酪蛋白溶液类似，切勿煮沸。让L-酪氨酸标准溶液冷却至室温。该溶液后续将被进一步稀释以制作标准曲线。</li>
<li>蛋白酶溶液。使用前立即用第6步制备的酶稀释液溶解蛋白酶。</li>
</ol>
如有必要，使用已知活性的固体蛋白酶样品，用酶稀释液溶解至0.1–0.2 单位/毫升。该溶液作为质量控制实验的阳性对照，并用于验证我们将进行的酶活性测定计算。
建立蛋白酶活性测定及标准曲线
<ol>
<li>开始本实验时，选择可容纳约 15 ml 的合适试管。每种待测酶需要 4 支试管：其中 1 支作为空白对照，其余 3 支用于检测蛋白酶三种稀释度的活性。采用三种稀释度有助于在最终计算时相互验证结果。<ol>
<li>向每组四支试管中加入 5 ml 的 0.65% 酪蛋白溶液，并在 37°C 水浴中平衡约 5 分钟。</li>
<li>向三支测试样品管中分别加入不同体积的待测酶溶液（空白管不加），轻轻旋转混匀后，准确在 37°C 下孵育 10 分钟。本实验所测定并比较的指标，即为孵育期间蛋白酶活性及其导致的酪氨酸释放量。</li>
</ol></li>
<li>孵育 10 分钟后，向每支试管中加入 5 ml 三氯乙酸（TCA）试剂以终止反应。随后，向每支试管（包括空白管）中加入适量酶溶液，使各管中酶溶液的最终体积均为 1 ml。此步骤旨在校正酶自身对吸光度的影响，并确保各管总体积一致。将溶液在 37°C 下继续孵育 30 分钟。 在此 30 分钟孵育期间，可同时配制酪氨酸标准品稀释液。使用可容纳 8 ml 的 6 dram 试管（也可用聚丙烯离心管替代）。向六支试管中分别加入 1.1 mM 酪氨酸标准储备液，体积（ml）依次为：0.05、0.10、0.20、0.40、0.50；空白管中不加酪氨酸标准品。对于颜色变化较小的不纯测试样品，可能需要更低浓度的标准品。加入酪氨酸标准溶液后，向各标准管中加入适量纯化水，使总体积达到 2 ml。</li>
<li>30 分钟孵育结束后，使用 0.45 µm 聚醚砜（PES）注射器滤膜对各测试溶液及空白样品进行过滤，以去除样品中不溶性物质。<ol>
<li>将过滤后的测试样品和空白滤液各取 2 ml，加入可容纳至少 8 ml 的 4 dram 试管中。该类试管与配制标准品所用者相同。</li>
<li>向所有含标准品及标准空白的试管中加入 5 ml 碳酸钠溶液。为获得最佳结果，应立即加入 1 ml 福林试剂（Folin's reagent）。</li>
<li>加入碳酸钠以调节因添加福林试剂所引起的 pH 下降。</li>
<li>向测试样品及测试空白管中加入碳酸钠溶液，加入后溶液会变浑浊。随后加入福林试剂，该试剂主要与游离酪氨酸发生反应。</li>
<li>轻轻旋转混匀 dram 试管，并在 37°C 下孵育 30 分钟。</li>
</ol>孵育结束后，应可观察到标准品管的颜色呈梯度变化，与所加酪氨酸量相对应，酪氨酸浓度越高颜色越深。测试样品管中也可观察到明显的颜色变化。取 2 ml 上述溶液，用 0.45 µm 聚醚砜注射器滤膜过滤至合适的比色皿中。至此，实验步骤已完成，&nbsp;可进行分光光度计测定以记录吸光度值。</li>
</ol>
测定吸光度并计算酶活性
<ol>
<li>使用分光光度计在660 nm波长下测定各样品的吸光度，光程设置为1 cm。记录各标准品、标准空白、不同测试样品及测试空白的吸光度值。待所有数据收集完毕后，可绘制标准曲线。为生成该曲线，需计算标准品与标准空白之间的吸光度差值，此差值对应于标准溶液中酪氨酸含量所引起的吸光度。完成该简单计算后，使用绘图软件绘制标准曲线：以5个标准品中每个的微摩尔数（μmol）为X轴，以其对应的吸光度变化值为Y轴进行作图。 
<table style="width: 416px; height: 118px;" border="0">
<tbody>
<tr>
<td style="text-align:center">酪氨酸标准品体积 </td><td style="text-align:center">酪氨酸微摩尔 </td>
</tr>
<tr>
<td style="text-align:center">0.05</td>
<td style="text-align:center">0.055</td>
</tr>
<tr>
<td style="text-align:center">0.10</td>
<td style="text-align:center">0.111</td>
</tr>
<tr>
<td style="text-align:center">0.20</td>
<td style="text-align:center">0.221</td>
</tr>
<tr>
<td style="text-align:center">0.40</td>
<td style="text-align:center">0.442</td>
</tr>
<tr>
<td style="text-align:center">0.50</td>
<td style="text-align:center">0.553</td>
</tr>
</tbody>
</table>
</li>
<li>输入数据点后，生成最佳拟合直线及其对应的斜率方程。 通过计算待测样品吸光度与试剂空白吸光度之间的差值，确定待测样品的吸光度变化。将其中一个待测样品的吸光度值代入斜率方程并求解，可得到该特定蛋白水解反应中释放的酪氨酸微摩尔数。为获得以单位每毫升（U/mL）表示的酶活性，请进行如下计算： （释放的酪氨酸当量，单位：μmol）×（11） 酶的单位/毫升 = __________________________________________ (1) × (10) × (2) 11= 检测反应总体积（单位：毫升） 10= 根据单位定义的检测时间（单位：分钟） 1= 所用酶的体积（单位：毫升） 2= 比色测定中使用的体积（单位：毫升） 取由斜率方程得到的释放的酪氨酸当量微摩尔数，乘以测定反应的总体积（单位为毫升），本实验中为11毫升。将该值除以三个参数：测定反应时间（本实验为10分钟）、测定中使用的酶液体积（该体积可变，此处以1毫升为例）以及比色检测所用的体积（根据比色皿不同可能有所差异，本实验使用2毫升）。</li>
<li>微摩尔酪氨酸除以时间（分钟）得到蛋白酶活性的测量值，称为“单位”。我们可以约去分子和分母中的体积单位，得到以单位/毫升（units/ml）表示的酶活性。为了确定溶解于酶稀释液中的固体蛋白酶样品的活性，我们将单位/毫升（units/ml）的活性值除以该测定中最初使用的固体浓度（毫克/毫升，mg/ml），最终得到以单位/毫克（units/mg）表示的活性。 酶单位/毫升 单位/毫克固体 = _____________________ 毫克固体/毫升酶 </li>
</ol>

<ol><li>Anson, M. L. J. Gen. Physiol. 22, 79-89 (1938).</li>
<li>Folin, O., Ciocalteau, V. J. Biol. Chem. 73, 627- (1929).</li>
</ol>

我们刚刚向您展示了如何使用Sigma的通用蛋白酶活性检测方法来分析蛋白酶活性。此外，该检测方法还可用于确保您收到的蛋白酶在用于实验前具有精确测定的活性。如您所见，在进行此操作时，至关重要的是要记住缓慢加热酪蛋白和酪氨酸溶液，切勿将其煮沸。同时，必须为标准品以及每个待测样品分别配制不同的空白对照。

<table><tbody><tr><td>蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4630</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾三水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>酪蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7078</td><td></td></tr><tr><td>三氯乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0699</td><td></td></tr><tr><td>Folin &amp; Ciocalteu 酚试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9252</td><td></td></tr><tr><td>无水碳酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠三水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1000</td><td></td></tr><tr><td>L-酪氨酸，游离碱基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶谱分析试剂盒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PP0500</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶荧光检测试剂盒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PF0100</td><td></td></tr></tbody></table>

西格玛非特异性蛋白酶活性测定——以酪蛋白为底物

Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

蛋白酶可断裂肽键。在实验室中，通常需要测定和/或比较蛋白酶的活性。Sigma 的非特异性蛋白酶活性检测法可作为标准化流程用于测定蛋白酶活性，这也是我们在质量控制过程中所采用的方法。在此检测中，酪蛋白作为底物。当待测蛋白酶消化酪蛋白时，酪氨酸及其他氨基酸和肽片段被释放出来。福林-酚试剂（Folin and Ciocalteu's Phenol，即福林试剂）主要与游离的酪氨酸反应，生成蓝色的显色物，该显色物可通过分光光度计测定其吸光度值进行定量。从酪蛋白中释放出的酪氨酸越多，生成的显色物越多，表明蛋白酶的活性越强。由蛋白酶活性产生的吸光度值需与标准曲线进行比较，该标准曲线是通过将已知量的酪氨酸与福林-酚试剂反应，以关联吸光度变化与酪氨酸微摩尔数量的关系而建立的。通过标准曲线，可确定蛋白酶样品的活性，以“单位”（Units）表示，即每分钟从酪蛋白中释放的酪氨酸当量的微摩尔数。
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蛋白酶可断裂肽键。在实验室中，通常需要测定和/或比较蛋白酶的活性。Sigma 的非特异性蛋白酶活性检测法可作为标准化流程用于测定蛋白酶的活性。

蛋白酶可断裂肽键。在实验室中，通常需要测量和/或比较蛋白酶的活性。Sigma的非特异性蛋白酶...

蛋白酶在实验室中可断裂肽键。通常需要测量或比较蛋白酶的活性。西格玛的通用蛋白酶活性检测法可作为标准流程用于测定蛋白酶活性，这也是我们在质量控制过程中所采用的方法。在此实验中，当待测蛋白酶消化酪蛋白（casian）时，酪蛋白作为底物。反应会释放出酪氨酸及其他氨基酸和肽段片段。游离的酪氨酸随后与福林酚试剂（fallen and cyl cals phenol 或 fallen reagent）反应，生成一种蓝色的生色团，该产物可通过分光光度计测定其吸光度值，进行定量检测。从酪蛋白释放的酪氨酸越多，生成的显色基团就越多，蛋白酶的活性也就越强。通过蛋白酶活性产生的吸光度值会与标准曲线进行比较，该标准曲线是通过将已知量的酪氨酸与福林-酚试剂（FC试剂）反应，以关联吸光度的变化而建立的。根据标准曲线得出的酪氨酸微摩尔数，可以确定蛋白酶样品的活性单位，即每分钟从酪蛋白释放的酪氨酸当量的微摩尔数。您好，我叫Carrie Cup Vineyard，是位于密苏里州圣路易斯市的Sigma Aldridge DeKalb工厂的一名科学家。今天，我将向您展示一种在 Sigma Aldridge 检测蛋白酶活性的通用方法。我们主要在质量控制环节使用该检测方法，以确保蛋白酶在直接运送至您实验室之前具有足够的活性。在开始检测之前，我们需要确保以下试剂已正确配制。50 毫摩尔的磷酸钾缓冲液，pH 7.5。使用前将溶液置于 37 摄氏度。将 6.5 毫克溶于 1 升溶液中，配制成 0.65%（质量/体积）的 kasian 溶液。在温和搅拌下，将溶液温度逐渐升高至 80 至 85 摄氏度，持续约 10 分钟，直至形成均匀分散体系。切勿将溶液煮沸，这一点非常重要。如有必要，可用氢氧化钠和盐酸调节 pH 值。通过将 6.1 当量的储备液与纯化水按 1 比 55 的比例稀释，配制 110 毫摩尔的三氯乙酸溶液，其中加入 0.5 毫摩尔的硫酸亚铁或酚试剂，该溶液将与酪氨酸反应，产生可测量的颜色变化。这将直接与蛋白酶的活性相关。使用无水碳酸钠53毫克/毫升溶于纯化水配制的500毫摩尔/升碳酸钠溶液，以及酶稀释液，后者由10毫摩尔/升醋酸钠缓冲液（含5毫摩尔/升钙离子，pH 7.5）组成，在37摄氏度条件下使用。该溶液用于溶解固态蛋白酶样品或稀释酶溶液。将L酪氨酸标准储备液配制成初始浓度为1.1毫摩尔、即0.2毫克/毫升的L酪氨酸水溶液，并在纯化水中轻轻加热，直至酪氨酸完全溶解。与茜素溶液相同，切勿煮沸此溶液。让L酪氨酸标准溶液冷却至室温。如有需要，将此溶液进一步稀释以制备标准曲线，所用为已知活性的固体蛋白酶样品，用酶稀释液溶解至每毫升0.1至0.2单位。该溶液在质量控制检测中作为阳性对照，并用于验证我们为测定酶活性所进行的计算。现在我们已准备好所有试剂，且均已达到正确温度，接下来将开始进行蛋白酶活性检测。开始本实验时，选择可容纳约 15 毫升的合适小瓶。每种待测酶需要四个小瓶，其中一个用作空白对照，其余三个用于测定三份样品的活性。在将蛋白酶进行三种稀释时，为验证最终计算结果的准确性，需对每组四个小瓶分别加入五毫升的0.65%壳聚糖溶液，并将其置于37摄氏度水浴中平衡约五分钟。然后向其中三个测试样品小瓶中加入不同浓度的酶溶液，空白对照组不加。通过轻轻旋转混匀后，在37摄氏度下准确孵育10分钟。在该孵育时间内，蛋白酶活性以及随之释放的酪氨酸将被测定，并在各测试样品间进行比较。孵育10分钟后，向每支试管中加入5毫升三氯乙酸（TCA）试剂。然后向每支试管（包括空白管）中加入适量的酶溶液，使每支试管中酶溶液的终体积均为1毫升。这样做的目的是为了扣除酶自身对吸光度的贡献。现在将溶液在 30 摄氏度下孵育 30 分钟。在此 30 分钟孵育期间，可准备酪氨酸标准品稀释液，该稀释使用六个 DR 管进行。可轻松将八毫升溶液加入六个小瓶中。向各管中分别加入1.1毫摩尔的酪氨酸标准储备溶液，体积（毫升）依次为：0.05、0.1、0.2、0.4和0.5。空白管中不加入任何酪氨酸标准溶液。对于颜色变化较小的IPU测试样品，可能需要降低标准品浓度。加入酪氨酸标准溶液后，向各标准品中加入适量纯化水，使体积达到2毫升。孵育后，过滤各测试溶液及空白对照溶液。使用0.45微米的注射器滤器，将两毫升的测试样品和空白滤液分别加入四个至少可容纳八毫升的DR小瓶中。可使用与标准溶液配制时相同类型的小瓶。向所有含标准溶液及标准空白的小瓶中加入五毫升碳酸钠，为获得最佳结果，应立即随后加入已落下的试剂。然后向测试样品和测试空白中加入碳酸钠。您会注意到，这些溶液在加入碳酸钠后会变得浑浊。然后加入落下的试剂，该试剂将与游离的酪氨酸发生反应。随后通过轻轻旋转混合 DRAM 小瓶，并在37摄氏度下孵育30分钟。孵育结束后，您会注意到标准品呈现出与所加酪氨酸量相对应的颜色梯度，酪氨酸浓度越高，颜色越深。您还可以注意到测试样品中明显的颜色变化。使用0.45微米的注射器滤膜和合适的比色皿过滤2毫升上述溶液。完成检测后，接下来我们将样品转移至分光光度计，记录吸光度值。使用分光光度计在660纳米波长下测定我们样品的吸光度。光程设置为1厘米，记录标准品、标准空白、不同测试样品以及测试空白的吸光度值。待所有数据收集完毕后，我们即可绘制标准曲线。为了绘制标准曲线，必须计算标准品与标准品空白之间的吸光度差值。该吸光度值反映了标准溶液中酪氨酸含量所对应的吸光度。经过简单计算后，我们将各标准品的吸光度变化值作为纵坐标（Y轴），各标准品中酪氨酸的微摩尔数（μmol）作为横坐标（X轴），绘制出标准曲线。输入数据点并生成最佳拟合曲线后，通过计算待测样品吸光度与待测空白样品吸光度之间的差值，得到待测样品的吸光度变化值。观察标准曲线，在Y轴上找到其中一个待测样品的吸光度值，然后沿与X轴平行的方向画一条线，直至与标准曲线相交的点为止。然后根据此时测得的 X 坐标，可得到该特定蛋白水解反应过程中释放的酪氨酸的量（单位为微摩尔）。为计算酶活性（单位为每毫升的活性单位），请进行如下计算：取标准曲线得出的释放的酪氨酸当量微摩尔数，乘以反应体系的总体积（单位为毫升），在本实验中为 11 毫升。然后将该数值除以另外三个参数。检测时间，我们进行了10分钟；检测中所用酶的体积，该体积可变。我们使用一毫升。氯比色检测中所用的毫升体积，可能根据您的Q vet而有所不同。我们使用两毫升。以分钟为单位的时间除以酪氨酸的微摩尔数，得到我们称为“单位”的蛋白酶活性测量值。我们可以将分子和分母中的体积单位相互抵消，最终得到以每毫升单位数表示的酶活性测量值。为了测定用酶稀释液稀释后的固体蛋白酶样品的活性，我们将每毫升单位数的活性除以该测定中最初使用的固体浓度（单位为毫克/毫升），从而得到以每毫克单位数表示的活性。我们刚刚向您展示了如何使用Sigma的通用蛋白酶活性测定法来分析蛋白酶活性。如您在操作此实验步骤时所见，必须牢记：务必缓慢加热酪蛋白溶液和酪氨酸溶液，切勿将其煮沸。此外，为您的标准品以及每个待测样品分别准备不同的空白对照至关重要。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的蛋白酶活性实验顺利成功。

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