Name: 在使用分馏爪蟾卵提取物的体外核大会 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-02T13:52:00.000+00:00
Duration: 4 min 49 s
Description: 学习使用非洲爪蟾卵提取物进行体外核组装的方法，结合精子染色质与膜囊泡形成功能性细胞核。该技术可用于研究核膜形成机制及细胞生物学中的核过程。

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该实验方法的完整文字方案可在<a href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471143031/cp/cpcb/article/cb1110/current/abstract ">《细胞生物学实验指南》</a>中获取。

作者无任何利益冲突需要披露。

利用分离的非洲爪蟾卵提取物进行体外核组装

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

核膜组装是细胞分裂周期中的关键步骤；该过程可通过在试管中结合非洲爪蟾精子染色质、细胞质提取物和轻膜组分在体外重现。由此形成的完整细胞核包含具有核孔复合体的核膜，并且这些重建的细胞核能够执行正常的核功能。

核膜组装是细胞分裂周期中的关键步骤；该过程可通过在试管中结合非洲爪蟾精子染色质、细胞质提取物和轻质膜组分来体外重现。由此形成的完整细胞核包含带有核孔复合体的核膜，并且这些重建的细胞核能够执行正常的核功能。

核膜组装是细胞分裂周期中的关键步骤；通过将非洲爪蟾精子与...在试管中结合，可实现该过程的体外重建。

爪蟾卵提取物可作为细胞事件（如细胞核组装和核蛋白输入）体外重建所需的细胞质和细胞器材料。当将精子染色质DNA加入粗制或分级分离的XUS卵提取物中时，提取物中存在的膜囊泡会结合到染色质表面，发生融合，并整合核孔复合物组分，从而形成具有完全功能的合成细胞核。通过免疫耗竭提取物和蛋白质编辑技术，可进一步表征这些过程的分子基础。大家好，我叫Marie Cross，是佐治亚州亚特兰大市埃默里大学细胞生物学系Maureen Power博士实验室的一名研究生。今天我们将向您展示如何使用分离的非洲爪蟾卵提取物在体外构建细胞核。该实验流程包括以下步骤：进行核组装反应以及评估细胞核的形成情况。那么，让我们开始。为了启动核的组装，取一份分馏的胞质溶胶，加入磷酸肌酸（来自0.2摩尔的储备液），使其终浓度为20毫摩尔。然后加入肌酸激酶（来自5毫克/毫升的储备液），使其终浓度为50微克/毫升。最后，使用0.2摩尔的储备液加入20微摩尔的ATP。接着，将轻膜组分按1:10的比例加入细胞质组分中。这大致相当于原始粗提物中存在的膜量。通过上下吹打混合所有组分，使膜在提取物中充分分散。此步骤必须在加入精子染色质之前完成。随后，将精子染色质以所需浓度加入分馏提取物中，并立即使用截短吸头轻轻上下吹打，将提取物与精子染色质充分混匀。当将精子染色质加入提取物时，它会立即开始去浓缩，并变得容易受到剪切作用的影响。通常，这些反应在500微升离心管中进行，总体积小于100微升。卵提取物可支持形成多达8,000至9,000个。每微升中的细胞核在室温下孵育混合物一至两小时，以使细胞核形成。通过染色可观察到细胞核。大约30分钟后，新形成的细胞核将呈小椭圆形。DNA 仍处于高度凝缩状态，当在紫外通道中观察时，随着 DNA 的凝缩，细胞核应呈现为实心的浅蓝色，来自钩状旋转结构。此外，蓝色染色将变得不那么均匀，最终会出现黑色的间隙。通过在固定液中每只雄性加入一微克的三三二羧胺（three three diaa carbox amine）或 DHCC，可观察到核膜的形成。DHCC 是一种荧光脂溶性染料，可在荧光素通道中观察到。在细胞核形成的早期阶段，膜囊泡结合在染色质表面并开始成片融合，导致正在形成的膜呈现不均匀且不连续的外观。一旦膜结构完成，它会在核表面平滑展开，并在DNA周围呈现为均匀且连续的环状边缘。由于未整合到细胞核中的膜囊泡的存在，周围细胞质中会存在一定程度的背景荧光。我们刚刚向您展示了利用非洲爪蟾卵提取物中的可溶性组分和轻膜组分进行的体外细胞核重建实验。需要记住的是，粗提物可用于核组装，但冻融后则不可使用。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

在使用分馏爪蟾卵提取物的体外核大会

粗制和分级的非洲爪蟾卵提取物可用于提供重建细胞过程所需的组分，以进行形态学和生物化学分析。通过卵细胞裂解及差速离心法制备粗制提取物，进而用于制备分级提取物和轻质膜组分。...

非洲爪蟾卵提取物的制备与分级分离

本文演示了将核输入底物进行细胞质显微注射至Xenopus...

非洲爪蟾卵母细胞的显微注射

本视频方案演示了一种通过将转基因导入精子细胞核，随后将其移植到未受精卵中，从而生成转基因Xenopus...

通过限制性内切酶介导的整合与核移植技术生产转基因Xenopus laevis

Xenopus tropicalis 卵提取物的制备用于鉴定微管相关RNA

本文描述了一种利用放射性标记和荧光素酶融合蛋白在Xenopus卵提取物中分析蛋白质降解的方法，并介绍了该方法在小分子蛋白质降解调节剂高通量筛选中的应用。...

在Xenopus卵提取物中重建β-catenin降解过程

我们描述了操作Xenopus laevis未成熟卵母细胞、卵母细胞体外成熟为卵子以及胞质内精子注射的方法。in...

操作与 体外 成熟 非洲爪蟾 卵母细胞，继以胞质内精子注射，用于研究胚胎发育

染色体高度凝缩的有丝分裂染色质去凝缩的分子机制尚不明确。我们提出一种基于从HeLa细胞分离的有丝分裂染色质簇建立的无细胞检测方法 Xenopus laevis 能够真实重建解凝过程的卵提取物 体外.

一种无细胞体系检测方法用于研究有丝分裂末期染色质去凝集过程

我们描述了一种利用Xenopus卵母细胞和动物帽系统进行基因表达克隆的方法，可用于筛选能够诱导有反应能力的外胚层产生应答的基因，并讨论了对这些基因进行后续分析的技术。该系统在多种基因产物的功能鉴定中具有重要应用价值。...

使用 Xenopus 卵母细胞表达系统进行功能克隆

细胞及细胞内比例调控的机制仍不明确。Xenopus...

使用Xenopus laevis胚胎提取物研究细胞核大小调控机制的无细胞实验

我们提出了一种用于生成 体外 通过包封卵母细胞提取物在单细胞水平实现自我维持的有丝分裂振荡 非洲爪蟾...

在无细胞微乳液中重建细胞周期振荡 非洲爪蟾 卵母细胞提取物

我们描述了一种制备和实时成像非洲爪蟾（Xenopus...

Xenopus laevis 卵提取物制备及活体成像方法用于可视化动态胞质结构

学习使用非洲爪蟾卵提取物进行体外核组装的方法，结合精子染色质与膜囊泡形成功能性细胞核。该技术可用于研究核膜形成机制及细胞生物学中的核过程。

利用分离的非洲爪蟾卵提取物进行体外核组装

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