利用分离的非洲爪蟾卵提取物进行体外核组装

爪蟾卵提取物可作为细胞事件（如细胞核组装和核蛋白输入）体外重建所需的细胞质和细胞器材料。当将精子染色质DNA加入粗制或分级分离的XUS卵提取物中时，提取物中存在的膜囊泡会结合到染色质表面，发生融合，并整合核孔复合物组分，从而形成具有完全功能的合成细胞核。通过免疫耗竭提取物和蛋白质编辑技术，可进一步表征这些过程的分子基础。

大家好，我叫Marie Cross，是佐治亚州亚特兰大市埃默里大学细胞生物学系Maureen Power博士实验室的一名研究生。今天我们将向您展示如何使用分离的非洲爪蟾卵提取物在体外构建细胞核。该实验流程包括以下步骤：进行核组装反应以及评估细胞核的形成情况。

那么，让我们开始。为了启动核的组装，取一份分馏的胞质溶胶，加入磷酸肌酸（来自0.2摩尔的储备液），使其终浓度为20毫摩尔。然后加入肌酸激酶（来自5毫克/毫升的储备液），使其终浓度为50微克/毫升。

最后，使用0.2摩尔的储备液加入20微摩尔的ATP。接着，将轻膜组分按1:10的比例加入细胞质组分中。这大致相当于原始粗提物中存在的膜量。

通过上下吹打混合所有组分，使膜在提取物中充分分散。此步骤必须在加入精子染色质之前完成。随后，将精子染色质以所需浓度加入分馏提取物中，并立即使用截短吸头轻轻上下吹打，将提取物与精子染色质充分混匀。

当将精子染色质加入提取物时，它会立即开始去浓缩，并变得容易受到剪切作用的影响。通常，这些反应在500微升离心管中进行，总体积小于100微升。卵提取物可支持形成多达8,000至9,000个。

每微升中的细胞核在室温下孵育混合物一至两小时，以使细胞核形成。通过染色可观察到细胞核。大约30分钟后，新形成的细胞核将呈小椭圆形。

DNA 仍处于高度凝缩状态，当在紫外通道中观察时，随着 DNA 的凝缩，细胞核应呈现为实心的浅蓝色，来自钩状旋转结构。此外，蓝色染色将变得不那么均匀，最终会出现黑色的间隙。通过在固定液中每只雄性加入一微克的三三二羧胺（three three diaa carbox amine）或 DHCC，可观察到核膜的形成。

DHCC 是一种荧光脂溶性染料，可在荧光素通道中观察到。在细胞核形成的早期阶段，膜囊泡结合在染色质表面并开始成片融合，导致正在形成的膜呈现不均匀且不连续的外观。

一旦膜结构完成，它会在核表面平滑展开，并在DNA周围呈现为均匀且连续的环状边缘。由于未整合到细胞核中的膜囊泡的存在，周围细胞质中会存在一定程度的背景荧光。我们刚刚向您展示了利用非洲爪蟾卵提取物中的可溶性组分和轻膜组分进行的体外细胞核重建实验。

需要记住的是，粗提物可用于核组装，但冻融后则不可使用。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。