使用激光镊子在体外操控分离的神经元

阿什金首次证明了激光镊子或光阱是操控微观微米级生命物体的有力工具。在本视频中，我们将展示如何应用这一技术来捕获和移动神经元。这是光镊工作站。

绿色箭头显示了激光束通过显微镜光学系统所经过的路径。当显微镜物镜聚焦的激光束被细胞折射时，改变光线方向的力作用于细胞，使细胞向焦点中心移动。

这会产生皮牛顿量级的力，足以在培养基中拉动细胞。在本视频中，我们将介绍培养皿的制备、视网膜细胞的准备、细胞在培养皿上的接种、光镊操控以及细胞生长的观察。由于细胞容易黏附在玻璃表面，我们需要创建一个抗细胞黏附的区域，以便利用光镊轻松捕获细胞。

培养皿的一半涂有聚HEMA（一种抗细胞黏附的聚合物），另一半则涂有细胞粘附基质1（一种支持我们细胞生长的基质）。首先，在培养皿的细胞黏附侧识别出一个细胞。

然后将另一个细胞捕获在聚合物侧，并转运至黏附侧，使两个细胞配对。制备培养皿时，我们使用吹尘消毒的Polystar 35毫米培养皿。首先，用小型车床或台钻在底部钻一个一厘米的孔。

取经酸处理清洁的盖玻片，将其直立放置于无尘环境（如通风橱）中。取溶于95%酒精中的聚HEMA溶液，仅在一侧盖玻片的上部滴加数滴。待聚HEMA自然干燥后，标记盖玻片上含聚HEMA的一侧。

将 S 型挡板安装在培养皿底部的孔周围。使用 S 型挡板将盖玻片粘附到培养皿上。确保聚酰胺位于内侧，并确保窗台挡板的缝隙中无泄漏。

将盖玻片放置好，使聚HEMA涂层的边缘位于培养皿中央。让培养皿干燥两到三天，然后用钻石笔在培养皿底部划出标记，作为将培养皿定位在显微镜载物台上的参考点。将培养皿放入超净台中，并在紫外灯下灭菌。

在培养皿的非多聚体侧滴加一至两滴山羊抗US抗体溶液，注意避免将溶液滴加到多聚半涂层上，室温孵育约三小时。去除抗体溶液，用无菌林格液洗涤。在同一区域加入细胞一抗溶液，4℃孵育过夜，以备次日实验使用。

我们实验室的细胞来源于成年水生期蝾螈的视网膜。将视网膜解剖并取出后，用酶进行消化处理。随后可将分离的细胞接种至培养皿中进行培养。

摘除眼睛，解剖并移除角膜，将眼杯置于无菌林格液中。

用弯头镊子的边缘将视网膜从眼球杯中挖出，使其分离。将二氧化碳和氧气通入含有丙烷的任氏液中，然后通过超细的0.2微米滤器进行灭菌。将视网膜置于酶溶液中，在持续振荡条件下消化约40分钟，以分散组织。

经过三次洗涤后，视网膜通过三通装置进行解离。使用直径3毫米的球状移液管，分离的细胞在接种前已准备就绪。将含有培养基的培养皿置于显微镜载物台上，并利用培养皿底部的划痕标记进行适当定位。

这使得今后能够重复精确复制培养皿的位置。随后将细胞接种于培养皿的聚HEMA表面和细胞一侧表面。通过操纵杆控制培养皿在显微镜载物台上的位置以及激光功率。

首先，我们识别出贴附在培养皿一侧的细胞。这是一种可通过其树突辨认的视网膜多极细胞。该细胞位置的坐标已被保存。

这是一个位于培养皿拒斥多极细胞一侧的视杆感光细胞。将培养皿降低，细胞被激光捕获并从培养皿底部提起。现在正将该细胞转运至培养皿的另一侧，即多极细胞所在的位置坐标处。

实际上，细胞是静止的，移动的是培养皿。此时细胞正在经过聚血涂层的边缘。

从细胞延伸出的突起是轴突末梢。该细胞远离培养皿底部的碎片和其他细胞，避免了对其运动的阻碍。在背景中可见培养皿底部细胞的散焦图像。

将杆状细胞运送到多极细胞，并可精确地定位在距离该细胞的指定位置和距离处。随后抬起培养皿，细胞即黏附于细胞基质上。该操作的主要优势在于，可选择需要移动的特定细胞，并且所有操作均可在封闭的无菌环境中进行。

细胞间的相互作用可以通过延时录像或数字摄影进行监测。激光镊子可与任何生物学技术结合使用，例如，此处采用荧光技术，展示了被激光镊子移动的细胞连接点处存在突触蛋白。