Name: 研究与基于荧光素酶的记者基因检测膜生源 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-07T14:36:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: 学习基于荧光素酶的报告基因检测技术，用于研究吞噬作用诱导的基因表达变化与膜生源过程。本方法采用Dual-Glo™系统分析脂质合成通路调控机制，为细胞生物学研究提供可靠工具。

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细胞培养
<ol>
<li>人胚胎肾293（HEK293）细胞的储备培养物在含有“培养基A”的10 cm培养皿中培养，培养基A由添加了抗生素混合液（每毫升含100单位青霉素和每毫升含100 µg硫酸链霉素）和10%胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）组成。</li>
<li>实验前准备细胞时，吸去培养基，用 5 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）溶液洗涤细胞两次。</li>
<li>随后移除 PBS，并加入 0.6 ml 含 0.25% 胰蛋白酶的溶液。</li>
<li>将培养皿在37˚C孵育约2分钟，直至细胞开始脱落。</li>
<li>加入5.5 ml 培养基A以中和胰蛋白酶，随后使用血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
<li>将细胞稀释至每毫升320,000个细胞，然后每孔加入0.1毫升，接种于多聚赖氨酸包被的96孔培养板中。</li>
<li>将培养皿放入37˚C、含8.8% CO2的组织培养孵箱中，培养24小时。</li>
</ol>
转染
<ol>
<li> 在准备转染实验时，应考虑每个实验条件需要设置多少个重复，以及每个样品转染的质粒用量。我们通常每个条件设置三个重复，每孔转染50至100 ng质粒DNA。质粒混合物中应至少包含一个表达萤火虫荧光素酶的报告基因载体，以及一个由组成型启动子驱动表达海肾荧光素酶的对照质粒。 </li>
<li> 将质粒溶液加入1.5 ml微量离心管中，并为每个样品补充10 µl无血清且无抗生素的DMEM。例如，若需对20个孔中的每个孔转染50 µg DNA，则将200 µl DMEM加入1 µg DNA中。</li>
<li> 向DMEM/DNA溶液中每1 µg DNA加入3 µl ‘TransIT 293试剂’（Mirus），用移液器吹打混匀 &amp; 静置，让样品在室温下静置至少10分钟。</li>
<li>在此期间，从96孔培养板中移除培养基，并加入90 µl新鲜的培养基A。</li>
<li>向每个孔中加入 10 µl 的 DMEM/DNA/TransIT 293 混合物。</li>
<li>将培养皿放入37˚C、含8.8% CO2的组织培养孵箱中，培养24小时。</li>
</ol>
吞噬作用
<ol>
<li>制备含有培养基B（DMEM与Ham’s F12培养基1:1混合，添加抗生素和10%胎牛血清）的悬浮液，并加入0至1 mg/mL的0.75-µm乳胶微球。</li>
<li> 从96孔培养板中移除培养基，加入0.1 ml含介质B的珠悬浮液。</li>
<li>以1000 × g离心2分钟。</li>
<li>细胞随后在37˚C培养6至16小时。根据所使用的条件和驱动荧光素酶的启动子不同，可在1至3小时后检测到报告基因表达的增加。</li>
<li>在某些情况下，可能需要将细胞与微珠共同孵育30至60分钟，然后用PBS洗涤两次以去除未结合的微珠，再加入新鲜培养基，继续孵育细胞一段时间。</li>
</ol>
Dual-GloTM 荧光素酶检测
<ol>
<li>注意：本实验所用试剂盒的操作步骤在某些方面与制造商推荐的方案有所不同，已进行修改以减少每个样品所需的试剂用量。</li>
<li>配制1 M DTT溶液，分装成多个小份，于-20˚C保存。</li>
<li>配制裂解缓冲液，含20 mM Tris-HCl（pH 7.8）、10%（v/v）甘油和0.5%（v/v）Triton X-100。使用前，根据实验所需量分装，并每毫升加入1 µl的1 M DTT以及蛋白酶抑制剂混合物，使其终浓度为0.5至1倍。剩余的DTT溶液不得重复使用。</li>
<li>首次使用Dual-GloTM试剂盒时，将一瓶Dual-GloTM Luciferase Buffer（试剂盒提供）的全部内容物转移至一瓶Dual-GloTM Luciferase Substrate（试剂盒提供）中，配制成荧光素酶试剂。将未使用的荧光素酶试剂分装为每份10 ml，于-20˚C保存。</li>
<li>从组织培养孵箱中取出96孔板，置于冰上。吸除培养基，每孔加入40 µl裂解缓冲液，然后将板继续置于冰上30分钟。</li>
<li>在白色不透明96孔板（OptiplateTM-96，Perkin Elmer货号6005290）中，每孔分装15 µl荧光素酶试剂，然后每孔加入15 µl细胞裂解液。</li>
<li>室温孵育10分钟，随后在酶标仪中读取发光信号。</li>
<li>使用前立即按1份Dual-GloTM Stop &amp; Glo® Reagent（试剂盒提供）与100份Dual-GloTM Stop &amp; Glo® Buffer（试剂盒提供）的比例配制适量的海肾荧光素酶底物溶液。</li>
<li>向每孔加入15 µl海肾荧光素酶底物溶液，室温孵育10分钟，然后再次测定发光信号。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

利用基于荧光素酶的报告基因检测法研究膜生物发生

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

为研究膜生物合成过程中不同脂质合成途径的协调作用，采用一种膜生物合成快速且可诱导的实验系统十分有益。我们发现，吞噬乳胶微球是一种适用于此目的的实用方法，因为细胞在颗粒吞噬过程中会迅速合成膜脂，以补充因包裹颗粒而消耗的膜成分。本文中，我们描述了利用普洛麦格（Promega）的Dual-Glo® Luciferase Assay System，通过基于荧光素酶的报告基因方法研究吞噬作用诱导的基因表达变化的实验步骤。

关键词：脂质合成，膜生物合成，吞噬作用，乳胶微球，荧光素酶报告基因，Dual-Glo® Luciferase Assay System，基因表达

本文介绍了利用Promega的Dual-Glo™ Luciferase Assay System，通过基于荧光素酶的报告基因方法研究吞噬作用诱导的基因表达变化的实验步骤。

为研究膜生物合成过程中不同脂质合成途径的协调作用，采用一种能够对膜……的实验系统进行研究将非常有益。

大家好，我主要研究不同脂质合成途径在膜生成过程中的协调机制。建立一个膜生物合成能够快速且可诱导发生的实验系统非常有用。我们发现，吞噬乳胶微球是一种特别适用于此类研究的实验模型，因为在吞噬过程早期，细胞会迅速合成新的膜结构，以补充因包裹颗粒而消耗的膜材料。在本视频中，我的同事 Ong Zang 将演示如何利用基于荧光素酶的报告基因检测方法来研究吞噬作用诱导的基因表达变化。大家好，我是来自哈佛大学分子与细胞生物学系 Leveraging Exon North 实验室的 X。今天，我将向您展示如何使用报告基因检测技术来分析吞噬作用后参与膜生物合成的基因调控机制。那么，让我们开始吧。在此实验中，我们使用人胚肾 293 细胞的培养物。这些细胞在 10 厘米培养皿中、使用培养基 A 进行培养，培养基 A 由改良的伊格尔必需氨基酸培养基（DMEM）组成，并添加 10% 胎牛血清（FBS）和抗生素混合物。采用标准化技术，将细胞从培养皿底部解离，计数后接种于多聚赖氨酸包被的 96 孔板中，培养 24 小时，直至开始转染。在进行转染时，我们通常将所有条件设置为三个重复，每个孔转染的质粒DNA总量为50至100纳克。转染混合物中应至少包含表达萤光素酶（firefly luciferase）的报告基因质粒，以及由组成型启动子驱动表达海肾荧光素酶（renal luciferase）的对照质粒。开始操作前，准备无血清且不含抗生素的DMEM培养基，并加入Trans-2-N3转染试剂：每孔转染使用10微升DMEM，每微克质粒DNA加入3微升Trans-2-N3转染试剂。例如，若每种转染需将 50 纳克 DNA 与 3 微升 trans 293 试剂加入至 200 微升 DMEM 中，共 20 个孔。通过反复吹打混匀溶液，然后在室温下静置至少 5 分钟。接着，将 DNA 分装至不同的微量离心管中。我们的质粒储备液浓度通常在每微升 10 至 100 纳克之间。将DM M转染混合物孵育5分钟后，转移至DNA管中，并用移液器再次混匀溶液。然后将样品在室温下静置20分钟。在20分钟孵育期间，从96孔培养板中移除培养基，并在孵育结束后，向每孔加入10 µL D-M-M-D-N-A转染复合物混合物，再补充19 µL新鲜培养基A。应将混合液直接用移液器加入现有的液体中。移液器吸头不得接触试管管壁。此外，需设置三个细胞孔作为未处理对照组，用于后续观察。此孔中的平均荧光素酶活性随后将被扣除作为背景。将96孔板放入37°C培养箱中，在37°C条件下培养细胞24小时。24小时培养结束后，我们开始诱导膜生物合成以及lax beads的生物合成。首先，制备含有细胞培养基和lax bead的悬浮液。为此，准备B培养基，即DMEM与Hemps F-12培养基等体积混合，并添加抗生素和10%胎牛血清（FBS）。然后加入浓度最高达每毫升1毫克的0.75微米乳胶微球。当然，每次实验均应设置不加微球的对照组。接下来，从96孔培养板中移除培养基，并向每孔加入100 µL磁珠悬浮液。加入悬浮液后，以1000 ×g离心2分钟。这有助于将磁珠聚集在孔底，促进吞噬作用。随后，在37 °C条件下孵育细胞6至16小时。根据所使用的条件和启动子，启动子驱动的荧光素酶表达可在一到三小时后被检测到。对于某些实验，可能需要将脂肪酸合成与脂质合成解偶联，例如研究特定药物对脂质合成的影响，同时不干扰颗粒的生成。在此类情况下，将细胞与微珠共同孵育30至16分钟，以允许细胞摄取微珠。孵育结束后，用 PBS 洗涤细胞两次，以去除未结合的微珠。然后加入新鲜培养基，继续孵育 6 至 16 小时，以进行报告基因表达。现在我们已准备好进行后续的检测实验。开始荧光素酶实验时，需配制一种裂解缓冲液，其中包含20 mM Tris-HCl（pH 7.8）、10%（体积比）甘油和0.5%（体积比）Triton X-100。根据实验所需量提前配制适量缓冲液。然后每毫升缓冲液中加入1 μL的1 M DTT。剩余的DTT溶液不得重复使用。首次使用双荧光检测试剂盒时，向样品中加入蛋白酶抑制剂混合物，使其终浓度为0.5至1倍。通过将一瓶双荧光素缓冲液的全部内容物转移至一瓶双荧光素酶底物中，配制萤火虫荧光素酶试剂。将未使用的荧光素酶试剂分装为10毫米的等份，于-20摄氏度保存。荧光素酶试剂准备好后，从组织培养孵育箱中取出96孔板，置于冰上。接着，通过抽吸去除培养基，然后每孔加入40微升裂解缓冲液，将板置于冰上30分钟。接下来，每孔加入15 µL荧光素酶检测试剂。在白色不透明的96孔板中，我们使用Perkin S optive 96孔板。然后每孔加入15 µL细胞裂解液，室温孵育10分钟。10分钟后，在酶标仪中读取发光信号。接着，对对照质粒进行海肾荧光素酶检测以获取数据。操作时，需在使用前立即配制，通过将1份双荧光素酶检测试剂与100份Stop & Glow底物溶液混合，制备适量的荧光素酶底物溶液。双发光，停止并加入发光缓冲液。接着，向每个孔中加入15 µL底物溶液。在室温下孵育平板10分钟，然后再次测量发光信号。请注意，我们对这些双荧光素酶检测的制造商推荐方案进行了修改。为了减少所需试剂的用量，对前样品进行了处理，现在可以使用酶标仪再次分析该培养板。一旦通过微孔板读板仪收集了数据，便可将其导入 Microsoft Excel 等电子表格程序中进行进一步分析。首先，计算三个未转染孔的平均值，并从每个数据点中减去该值。然后，将每个转染孔的值除以海肾荧光素酶的值，再计算每组三个重复样本的平均值、标准偏差和变异系数。在本示例中，我们使用了不同浓度的微珠，其数值在横轴上表示，对应于萤火虫荧光素酶与香草荧光素酶活性的比值。如您所见，该比值呈现出剂量依赖性增加。我们刚刚向您展示了如何利用基于荧光素酶的报告基因检测方法，测定低密度脂蛋白受体启动子在吞噬聚苯乙烯微珠刺激下的表达水平。进行此操作时，重要的是要记住，在转染时细胞的融合度应仅为80%至90%。就是这样。感谢观看，祝您的实验顺利。

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