补丁钳爪蟾卵母细胞中表达的离子通道

该程序从从 Opus Cytes 中去除 vilin 膜开始，以便成功形成膜片钳记录所需的抗千兆欧姆密封。一旦获得细胞膜片钳构型，就可以对移液器施加抽吸，以电方式进入细胞的细胞质，即所谓的全细胞贴剂构型。然后可以将移液器吸头从质膜上拉出，直到它弹回，以获得一小块膜，其中通道的胞外域暴露在浴液中，这被称为由外而外的贴片配置 Go.Hi，我是来自斯坦福大学分子与细胞生理学系 Miriam Goodman 博士实验室的 Austin Brown。

我是 Brandon Johnson，也来自 Goodman 实验室。在上一个视频中，我们演示了如何制作膜片钳移液器和用于电生理学的尖锐电极。今天，我们将介绍以 zpa 表示的离子通道的膜片钳记录。

因此，自 1970 年代后期由 S Sacramento 和 Air 开发以来，膜片钳记录已成为细胞中单个或多个离子通道电生理测量的重要技术。那么让我们开始吧。为了使膜片钳移液器能够接触到卵母细胞质膜，必须去除外绒蛋白膜。

首先，准备两套 5 号镊子。用锉刀稍微磨锐一组镊子。还要准备一个玻璃移液管，旁边用 7 英寸的牧场移液器修剪和火抛光，以防止细胞滑落，从包含 0.8 毫米正方形的网格中切出一个圆圈，然后将其粘在 60 毫米培养皿的底部。

如果两次使用之间保持清洁，这道菜可以无限期地重复使用。然后用高渗溶液填充培养皿的一半，并置于解剖显微镜下。现在用抛光的 pester 从孵育溶液中取出 1 到 3 个 opus Cytes，移液管并放入培养皿中。

等待 15 秒到 2 分钟，让细胞开始收缩。当它们收缩时，vilin 膜将开始变得几乎不可见，成为细胞上的透明层。较长的时间使细胞更容易剥落，较短的时间会导致细胞更健康。

对于修补，选择没有漩涡或缺陷的健康卵母细胞用一对镊子进行剥皮，轻轻抓住绒毛蛋白膜而不损坏质膜，另一只抓住同一位置附近，然后轻轻地使用两对镊子将透明膜撕开，将卵母细胞作为一个整体去除。接下来，用牧场移液器小心地将卵母细胞移动到记录室。请注意，去除 vilin 后细胞会很脆弱。

现在 OC 部位已经准备好了，我们准备在移液器吸头和卵母细胞膜之间形成高抗性密封或千兆密封。为此，请在记录移液管中加入生理盐水。使用与电极丝电接触的最小体积的溶液，以尽量减少移液器电容。

然后轻弹移液器数次，让气泡漂浮。将移液器滑到电极丝上并拧紧支架。接下来，用口腔移液器对装满的移液器施加正压。

该压力对于保持移液器在穿过液体界面并移向池时保持清洁至关重要。现在在腔室中找到细胞，并用移液管从浴中心出来强烈聚焦在细胞的边缘。卵母细胞上方的失焦尖端。

此步骤可最大限度地减少移液器在形成密封件之前在浴槽中花费的时间，这有助于保持移液器吸头清洁溶液中的污染物。接下来，将移液器放下到卵母细胞旁边的清晰焦点中。将其靠近大约 50 微米。

使用膜片钳软件，检查移液器的阻力。目标电阻约为 3 到 6 兆欧姆。然后使用电压偏移将电流归零，并在移液器上施加正压。

将尖端缓慢移向电解池，同时在尖端开始接触电解池时监测阻力。当尖端与电池接触时，电阻会增加。突然但轻轻地从正压切换到负压，绝对值大致相同。

阻力应增加并导致密封形成。通常，密封形成会在几秒钟内发生。偶尔需要 30 到 60 秒。

一旦电阻达到 1 千兆欧姆的释放压力到中性，我们现在就有了一个电池贴片。该方法对于细胞的正常环境（例如细胞骨架）对离子通道功能至关重要的记录非常有用。然而，内部和外部解决方案都不能改变。

在下一步中，我们将演示如何制作一个由外而外的补丁，它允许改变外部解决方案以创建由外而外的拓扑结构，在实现千兆密封后立即破坏膜。为此，请应用 1 伏特脉冲 1 毫秒。阻力应下降到略高于初始移液器阻力。

然后缓慢而平稳地将移液器从细胞中移开。您应该看到用移液器拉动细胞的一部分。在几秒钟内，电池会突然弹回，电阻应立即恢复到千兆自身水平。

现在，我们在这种配置中有一个由外向外的补丁，任何包含的离子通道的 OD 结构域都暴露在浴槽中。这对于使用阻滞剂等药物是必要的，这些药物可能仅与通道的外部域相互作用。我们刚刚演示了如何对异种细胞中表达的离子通道进行膜片钳记录。

执行此程序时，请务必注意 10 吉欧姆范围内的较高电阻密封件更可取且使用寿命更长。根据我们的经验，可靠地获得这种质量的密封件取决于许多因素。最关键的参数包括使用着色均匀、无漩涡或缺陷的优质细胞，快速剥离细胞以最大限度地减少在收缩溶液中的时间，在实验的同一天拉出新的无尘移液器并在实验后一小时内抛光它们，通过检查验证移液器是否光滑和抛光， 从移液器进入浴槽开始保持压力，直到形成密封。

好了，就是这样。感谢观看。祝您的实验好运，打补丁愉快。