Name: 改进的膜片钳记录的压力抛光移液器 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: 学习利用热压抛光技术改良玻璃微电极形状，在保持尖端开口不变的前提下降低电极电阻。该方法适用于神经电生理学研究，可显著提升小型细胞膜片钳记录的信号质量。

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压力抛光技术是与 S. R. Lockery 合作开发的。

拉制移液管
使用如 Sutter P-97 Flaming/Brown 微电极拉制仪等拉针仪，制备约 10–20 根移液管。
<ol>
<li>选择合适的玻璃管。我们使用硼硅酸盐玻璃管（BF150-86-10，外径 = 1.5 mm，内径 = 0.86 mm）。妥善保存玻璃管，确保其清洁且无灰尘。</li>
<li>设计拉制程序。主要目标是获得接近所需尺寸的尖端开口，具体尺寸取决于应用需求。Sutter 公司的 P-97 Pipette Cookbook 2 是一份极佳的参考指南。</li>
<li>在显微镜下观察移液管，以确定开口直径和表面光滑度。丢弃表面粗糙、不均匀或形状不规则的尖端。对于标准膜片钳记录，最佳尖端开口直径为 2–4 μm。在相同开口直径下，较钝的尖端具有更低的电阻，这是更理想的情况。尖端的形状和大小可在后续抛光步骤中进一步调整。</li>
</ol>
压力抛光移液管
<ol>
<li>将移液器支架连接至洁净的压缩空气管路。使用调压阀将压缩空气管路压力调节至约40 PSI。将压缩空气管路连接至一个四通控制阀，以便控制移液器支架的压力开关。用一段管路将移液器支架连接至控制阀 &#x215B; 在Tygon中&reg; 管路</li>
<li>使用配备高压移液管夹持器、由脚踏板控制的抛光线圈、以及带有低倍和高倍（理想情况下为10x和100x）、长工作距离空气物镜的显微镜的抛光装置（微加工仪）。在整个操作过程中能够观察移液管开口至关重要。</li>
<li>可选:&nbsp;用疏水性绝缘材料包裹移液管，以降低电容并改善噪声特性（该技术参见“拉制移液管”）。</li>
<li>确认压力阀处于关闭位置。将移液器插入移液器支架中，并用手拧紧固定接头至 snug 状态。 安全须知如果将移液器过紧地插入移液器架中，气压会导致移液器从架中弹出。 </li>
<li>将移液管和夹持器放入显微拉制仪中。将移液管夹持器置于显微镜载物台上，使在低倍（10×）下可同时观察到尖端和抛光线圈。将尖端移至距灯丝约75微米处。注意灯丝在加热时会膨胀。</li>
<li>切换至高倍（100倍）物镜。此时，移液管尖端和抛光线圈均应处于焦平面内并位于视野中。若未同时清晰可见，请调节抛光线圈的高度（移液管位置不可调节）。移液管尖端与抛光线圈应分别靠近视野的对侧边缘。避免将线圈放置得过于靠近移液管尖端，因其加热后会膨胀，可能触碰移液管.</li>
<li>打开阀门，使加压空气进入移液管，加热移液管尖端，直至尖端后方的锥形部分开始向外膨胀。</li>
<li>在尖端过度膨胀之前停止加热。需要通过实验确定获得理想形状所需的距离、加热温度和时间。</li>
<li>可选：在无压力条件下通过抛光尖端来减小尖端开口直径。可重复步骤7和8，以精确调整移液管尖端的形状和尺寸。</li>
<li>关闭压力，将移液器枪头朝安全方向，取下移液器并放入洁净的储存盒中，以防灰尘污染。 安全须知：如果未关闭气压，移液器在拆卸时可能会从移液器架中弹出。</li>
</ol>
关于显微操作仪的注意事项
我们使用由市售现成部件组装而成的微电极拉制仪。（您也可以从一些公司购买压力抛光套件，例如 ALA Science、GlassWorx）。无论使用何种微电极拉制仪，关键是要配备足够优质的光学系统，以便观察尖端开口，其直径通常仅有几微米 &micro;直径约为 m。为此，我们使用长工作距离的 100 倍物镜。此外，将抛光线圈涂覆高熔点玻璃，以尽量减少金属蒸气在移液管上的沉积。
第3部分：预期结果
适度加压抛光可在不显著改变移液管开口直径的情况下降低其电阻。如有需要，本方案可用于制备开口小于1微米、电阻在5-10 MΩ之间的移液管。

<ol><li>Goodman, M. B., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure+polishing%3A+a+method+for+re-shaping+patch+pipettes+during+fire+polishing.%C2%A0%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. .</a> J Neurosci Methods. 100, 13-15 (2000).</li>
<li>Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. , Sutter Instrument. 
 
 <a target="_blank" href="http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf">http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf</a> (2008).</li>
</ol>

我们最初开发该方法是为了使移液管适用于对 C. elegans 中直径为 2-3 µm 的神经元进行膜片钳记录1。该方法目前在 Goodman 实验室常规使用。我们对移液管进行气压抛光，不仅用于记录微小的 C. elegans 神经元，还用于获得非洲爪蟾卵母细胞中表达的离子通道的巨膜片和单通道记录。对于特定的尖端开口直径，这种钝形设计可产生电阻更低的移液管。较低的移液管电阻可降低串联电阻，从而获得更低噪声的记录结果。

<table><tbody><tr><td>玻璃毛细管</td><td>耗材</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF150-85-10 (或类似产品)</td><td>该方法适用于除石英材质以外的任何类型毛细管。然而，我们建议使用带有灯丝的毛细管。</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM IL (或类似型号)</td><td>任何基础的倒置显微镜均可使用。但必须具备足够的放大倍数，以便在抛光过程中观察移液管。我们为此目的使用100倍长工作距离的金相镜头。</td></tr><tr><td>微电极拉制仪套件</td><td>工具</td><td>ALA Science</td><td>CPM-2</td><td>包含抛光线圈、控制器和脚踏开关。</td></tr><tr><td>气压源</td><td>工具</td><td>ALA Science</td><td>PR-60</td><td>用于提供高压的附件，包含合适的阀门。或者，也可使用实验室建筑内的压缩空气，配合过滤器/调压阀（设定为40 PSI）和四通阀（见下文）。</td></tr><tr><td>四通阀</td><td>工具</td><td>Cole-Parmer</td><td>A-98150-01</td><td>需要接头将阀门与管路连接。</td></tr><tr><td>带鲁尔接头的移液管 holder</td><td>工具</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MPH-6S20</td><td>使用雄性鲁尔转卡套接头将移液管 holder 连接到高压管路。</td></tr><tr><td>Tygon&amp;#174; 管路</td><td>工具</td><td>Cole-Parmer</td><td>06408-62</td><td>使用此管路连接移液管 holder 与四通阀。</td></tr></tbody></table>

用于改进膜片钳记录的拉针压力抛光技术

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

压力抛光是一种用于制备膜片钳记录用玻璃移液管的成型方法。我们最初开发该方法是为了制备适用于记录小型（&lt;3 μm）神经元胞体的移液管。其基本原理类似于玻璃吹制技术，结合气压与加热，对传统微电极拉制仪制备的膜片钳移液管进行形态修饰。该方法可应用于所谓的软质（钠钙玻璃）和硬质（硼硅酸盐玻璃）玻璃。一般而言，压力抛光可在不减小移液管尖端开口直径的情况下，将移液管电阻降低25%（Goodman 和 Lockery，2000）。该技术几乎适用于所有类型的玻璃，仅需在显微操作仪上加装一个高压阀门及配套装置即可。该技术对于记录超小型细胞（&lt;5 μm）至关重要，同时还能通过降低移液管电阻来改善单通道记录效果。这种钝形尖端也适用于穿孔式膜片钳记录，因为此类尖端形状可形成更大的膜膨凸，有利于穿孔操作。

本指南介绍如何改变玻璃微电极的形状。具体而言，通过加热和施加气压，可在不增大尖端开口的情况下加宽锥形部分，从而降低微电极的电阻。这对于获得小细胞的低噪声记录至关重要，同时在多种应用中具有实用价值。

压力抛光是一种用于制备膜片钳记录用玻璃移液管的成型方法。我们最初开发该方法旨在制备适用于……的移液管。

此操作首先在100倍放大倍数下，将移液器吸头置于抛光丝附近。接着打开气压和加热装置。该丝状加热元件。移液器吸头将膨胀形成钝头形状。关闭加热以获得更小的吸头开口。再次关闭压力和加热。大家好，我是来自斯坦福大学分子与细胞生理学系 Miriam Goodman 博士实验室的 Brandon Johnson。今天我们将向您展示一种压力抛光膜片电极的实验方法。在我们的实验室中，该方法被用于研究离子通道、膜片以及秀丽隐杆线虫神经元中的相关特性。那么我们开始吧。准备六到十个膜片钳电极。如有需要，可咨询本地专家，或参考我们提供的可视化实验视频《使用可编程拉制仪制备膜片钳电极和尖锐电极》以获得帮助。开始操作时，将压缩空气管路压力设置为约 40 PS.I，然后将压缩空气管路连接至四通控制阀。将一段塑料管连接至四通阀，并在塑料管的自由端安装一个高压移液管固定器。使用显微拉制仪进行抛光处理。我们使用 LA Scientific 公司的 Ccpm 两件套工具包。该装置包含一个高压移液管固定器、一个由脚踏板控制的铂金加热丝，以及一台配备低倍和高倍（10 倍和 100 倍）长工作距离物镜的显微镜。长工作距离的空气物镜最为理想，因为在实验过程中必须能够清晰观察移液管开口的情况。接下来，确认压力阀处于关闭位置。然后将移液器放入移液器支架中，并用手拧紧固定装置，以确保实验室安全。确保移液器牢固地固定在移液器支架中。否则，气压会导致移液管从 holder 中弹出。作为可选步骤，您可用疏水性绝缘材料（如石蜡）涂覆移液管，以降低电容并改善噪声特性。现在将装有移液管的 holder 置于微熔器上，并将移液管 holder 安放在显微镜载物台上，使在微熔器低倍 10 倍镜下可同时观察到尖端和抛光丝。将尖端移至距离灯丝约50微米处，然后切换到高倍100倍物镜，此时移液管尖端和抛光灯丝均应处于焦平面内并位于视野中。如果未满足该条件，则调整灯丝的高度。由于移液管位置无法调节，移液管尖端与灯丝应位于视野的相对两侧。避免将移液器尖端过于靠近灯丝，因为灯丝加热后会膨胀，可能触碰到移液器。当尖端和灯丝位置调整妥当后，转动阀门，使加压空气进入移液器，并加热移液器尖端，直至尖端后方的锥形部分开始向外膨胀。在尖端过度膨胀之前停止加热。需要通过实验来确定获得理想形状所需的距离、加热温度和时间。作为可选步骤，您还可以在无压力条件下对尖端进行抛光，以减小尖端开口直径。此外，请注意，这些抛光步骤可重复进行，以进一步优化。调整移液器尖端的形状和尺寸。抛光完成后，关闭压力，将移液器尖端指向安全方向。移除移液器并将其放入干净的储存盒中，以防止灰尘污染。为确保实验室安全，在取下移液器前务必关闭压力，否则移液器可能从移液器架中弹出。移除后，我们刚刚向您展示了如何通过压力抛光毛细管以改善膜片钳记录效果。进行此操作时，需注意务必使用高熔点玻璃涂覆抛光线圈，以尽量减少金属蒸气在毛细管上的沉积；同时，在毛细管暴露于加压空气时应格外小心。确保移液器牢固地固定在支架中，并在从支架上取下移液器之前关闭气源。操作到此结束。感谢观看。祝您压力抛光顺利，实验成功。

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改进的膜片钳记录的压力抛光移液器

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