Name: counting bacteria with dilution plates
Uploaded: 2023-04-30T07:09:34.000Z
Duration: 10 min 53 s
Channel: JoVE

1. Einrichtung
<ol><li>Ein Flussdiagramm mit allen Materialien, einem schrittweisen Versuchsprotokoll und einer Methode zum Entsorgen von Verbrauchsmaterialien sollte in ein Labornotizbuch geschrieben und in der Nähe des experimentellen Arbeitsbereichs aufbewahrt werden.</li>
	<li>Arbeitsbereiche sollten mit einem geeigneten Antiseptikum (70% Ethanol) sterilisiert werden, und der Experimentator sollte das Kontaminationsrisiko durch das Tragen sauberer Laborkleidung verringern, die sie auch vor Expositionsanomalien schützt. Geeignete Kleidungsstücke umfassen, sind aber nicht beschränkt auf laborkleidung, Latex- oder Nitrilhandschuhe, Googles, Atemschutzgeräte und geschlossene Schuhe. Es ist wichtig, die aseptische Technik jederzeit aufrechtzuerhalten.</li>
	<li>Bereiten Sie 90 ml mit 0,45% Saline vor. Mit einem sauberen abgestuften Zylinder 90 ml steriles Wasser messen und in einen sauberen Erlenmeyerkolben mit der Bezeichnung 0,45% Salzwassergeben. Wiegen Sie .405 g Natriumchlorid (Sigma-Aldrich NaCl S9888) und fügen Sie es dem Kolben mit der Bezeichnung 0,45% Saline hinzu. Immer wieder wirbeln, bis keine Lösung sichtbar bleibt.</li>
	<li>Nach Abschluss sollte der Experimentator alle Oberflächen neu sterilisieren und unerwünschte Organismen, Verdünnungsvorräte, Petrischalen oder Einweg-Impfschleifen gemäß den OSHA-Richtlinien entsorgen. Laborkleidung kann vor dem Händewaschen entfernt werden.</li>
</ol>2. Medienvorbereitung
<ol><li>Wählen Sie Medien aus, die für die Kultivierung eines gewünschten Organismus geeignet sind. In den meisten Szenarien würde eine Brühe ein ausreichendes Bakterienwachstum ermöglichen. Da hier Organismen aus einem Winogradsky-Protokoll gewünscht werden, wurde eine Kolonne aus Calciumcarbonat, Schwefel, Zellulose und Schlamm zusammengebaut und 7 Tage lang ungestört gelassen. Die vorgenannte Säule ist in aerobe, mikroaerophile und anaerobe Abschnitte unterteilt.</li>
	<li>Wählen Sie ein Medium, das für die Beschichtung des Organismus von Interesse geeignet ist. Die Supplementierung von flüssigen Medien mit mikrobiologischen Agar wird in der Regel als Erstarrungsmittel verwendet. LB Medium/Agar ist ausreichend, wenn Proben aus aeroben, mikroaerophilen und anaeroben Regionen der vorgenannten Säule geerntet werden. Hinweis: Proben aus der mikroaerophilen Region wurden für dieses Verfahren nicht geerntet. Diese Organismen sollten jedoch in Kerzengläsern angebaut werden. Die Einführung einer Kerze in diese Kultivierungskammer vor dem Versiegeln schafft eine sauerstoffarme Umgebung, die für die mikroaerophile Proliferation geeignet ist.</li>
	<li>Da wir 250 ml vorbereiten möchten, verwenden Sie 500 ml (oder größere) Erlenmeyerkolben, um ein Überkochen beim Autoklavieren zu verhindern. Beschriften Sie eine "Broth" und die andere "Agar".</li>
	<li>Bestimmen Sie die Menge an Medien, die zum Erstellen jeder Lösung erforderlich sind, indem Sie den Konzentrationsempfehlungen des Herstellers folgen. LB Agar, hier verwendet, wird durch die Kombination von 25g/L mit Reinstwasser hergestellt. Unser Volumen von 250 ml erfordert eine Lösung von 6,25 LB Agar/250 ml Wasser. In ähnlicher Weise wird LB Broth durch die Kombination des gleichen Verhältnisses von LB Broth und Wasser hergestellt. Da es nicht mit einem Erstarrungsmittel ergänzt wird, wird es nicht verhärten, wenn es gekühlt wird.</li>
	<li>Wiegen Sie die Medien und mischen Sie es mit Wasser in Proportionen, die den Herstellerempfehlungen entsprechen. Fügen Sie 6,25 g LB Agar zu einem Kolben mit der Bezeichnung "Agar" und 6,25 g LB Broth zu einem Kolben mit der Bezeichnung "Broth" hinzu. Fügen Sie 250 ml Reinstwasser in jeden Kolben.</li>
	<li>Aluminiumfolie über jeden Kolben wickeln und mit einem Autoklaven Medien mindestens 15 Minuten bei 121°C, 15 psi sterilisieren.</li>
	<li>Mit einem hitzebeständigen Handschuh oder Pad entfernen Sie die Kolben aus dem Autoklaven, wenn der Zyklus abgeschlossen ist, und legen Sie sie in ein 40-50°C Wasserbad.</li>
	<li>Sobald die entsprechende Temperatur erreicht ist, gießen Sie den Inhalt des Kolbens mit der Aufschrift "Broth" in einen 250 ml Erlenmeyer oder Rundbodenkolben. Beschriften Sie den 250 ml Kolben als "Lösung0".</li>
	<li>Erhalten Sie 10, 100mm x 15 mm sterile Petrischalen und kennzeichnen Sie sie mit dem Datum, dem Namen, der Art der verwendeten Medien und der Winogradsky-Säulenzone, aus der Organismen geerntet werden.</li>
	<li>Entfernen Sie den Kolben mit der Aufschrift "Agar" aus dem Wasserbad und beginnen Sie, in jede der 10 Petrischalen zu gießen. Jedes Gericht sollte nicht mehr als 15 ml zugesetzt werden. Dies kann auch mit einem Pipettentor und einer 25 ml serologischen Pipette durchgeführt werden, um die Genauigkeit zu verbessern. Verwenden Sie eine sterile Pipettenspitze, um vorhandene Blasen zu entfernen, und decken Sie dann mit den Plattendeckeln ab und lassen Sie sie über Nacht erstarren.</li>
</ol>3. Verdünnende Zubereitung
<ol><li>Bereiten Sie zehn Reagenzgläser vor, die 20 ml oder mehr in einem Rack lagern können, und beschriften Sie sie T1-T10. Jede Rohrnummer entspricht dem Verdünnungsfaktor, dem sie entspricht (d. h. T4 = 1x10-4 oder 0,0001 oder 1/10.000der der Lagerkonzentration).</li>
	<li>Pipetten 9 ml von 0,45% Saline in jedes der 10 Reagenzgläser.</li>
	<li>Saline-Rohlinge sind nun bereit, durch Autoklaven sterilisiert zu werden. Verwenden Sie Aluminiumfolie, um jedes der 10 Reagenzgläser zu bedecken und dann in ein autoklavkompatibles Reagenzglasregal zu übertragen. Mindestens 15 Minuten bei 121°C, 15 psi sterilisieren.</li>
	<li>Entfernen Sie Die Rohlinge mit hitzebeständigen Handschuhen und lassen Sie sie abkühlen. Bedecken und lagern Sie bei 4°C, bis sie benötigt werden, wenn die Rohre Raumtemperatur erreicht haben, oder wenn sie zum Anfassen abkühlen.</li>
</ol>4. Kultivierung des Zielorganismus
<ol><li>"Lösung0" mit einer einzigen Kolonie aus einer zuvor gestreiften Platte oder 50 l eines gefrorenen Bestands impfen. Erlauben Sie dem Zielorganismus Zeit, sich zu replizieren, indem Sie geimpfte "Lösung0"über Nacht mit Schütteln (falls erforderlich) in einen 37°C-Inkubator legen. (Hinweis: Der Kolben sollte abgedeckt werden, um eine Kontamination zu verhindern. Wenn der Zielorganismus aerob ist, verwenden Sie sterile Gaze und Baumwollstecker, um eine Kontamination zu verhindern. Wenn Sie Regionen der Winogradsky-Säule bewerten, entfernen Sie einfach 1 Gramm aus jeder gewünschten Zone (aerobe und anaerobe für die Zwecke dieser Studie) und setzen Sie in T1 erneut ab, bevor Sie mit Schritt 5.3 fortfahren.</li>
</ol>5. Serielle Verdünnung
<ol><li>Den Kolben mit der Aufschrift "Nährstoffbrühe" aus dem Inkubator beziehen und kräftig schütteln.</li>
	<li>Pipetten 1 ml "Lösung0"in das Reagenzglas mit der Bezeichnung T1. Vortex T1. Bei der Bewertung von Winogradsky-Explants 1 Gramm der gewünschten Zone wiegen und vor dem Wirbeln zu T1 hinzufügen. (Hinweis: Hier wird aus Gründen der Einfachheit 1 ml verwendet - es können auch kleinere oder größere Verdünnungsvolumina verwendet werden).</li>
	<li>Entfernen Sie 1 ml aus dem Reagenzglas T1 und fügen Sie es dem Reagenzglas T2 hinzu. Vortex T2.</li>
	<li>Entfernen Sie 1 ml aus dem Reagenzglas T2 und fügen Sie es dem Reagenzglas T3 hinzu. Vortex T3.</li>
	<li>Entfernen Sie 1 ml aus dem Reagenzglas T3 und fügen Sie es dem Reagenzglas T4 hinzu. Vortex T4.</li>
	<li>Entfernen Sie 1 ml aus dem Reagenzglas T4 und fügen Sie es dem Reagenzglas T5 hinzu. Vortex T5.</li>
	<li>Entfernen Sie 1 ml aus dem Reagenzglas T5 und fügen Sie es dem Reagenzglas T6 hinzu. Vortex T6.</li>
	<li>Entfernen Sie 1 ml aus dem Reagenzglas T6 und fügen Sie es dem Reagenzglas T7 hinzu. Vortex T7.</li>
	<li>Entfernen Sie 1 ml aus dem Reagenzglas T7 und fügen Sie es dem Reagenzglas T8 hinzu. Vortex T8.</li>
	<li>Entfernen Sie 1 ml aus dem Reagenzglas T8 und fügen Sie es dem Reagenzglas T9 hinzu. Vortex T9.</li>
	<li>Entfernen Sie 1 ml aus dem Reagenzglas T9 und fügen Sie es dem Reagenzglas T10 hinzu.</li>
</ol>6. Verbreitung Plating
<ol><li>100 l einer verdünnten Probe aus T1 direkt auf eine Petrischale. Dieser Schritt kann, muss aber nicht für jedes Rohr wiederholt werden.</li>
	<li>Erhalten Sie einen sterilen Einweg-Streustab oder Flamme sterilisieren eine Glasstreustange. Gleiten Sie in einer Bewegung im Uhrzeigersinn/gegen den Uhrzeigersinn den horizontalen Teil der Streustange, um die Probe gleichmäßig innerhalb der Petrischale zu verteilen.</li>
	<li>Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Zone der Winogradsky-Spalte, die ausgewertet werden soll.</li>
	<li>Inkubieren Sie Platten in einem 37°C Inkubator für 24 Stunden. Verwenden Sie für anaerobe Organismen eine anaerobe Kammer.</li>
</ol>7. Streaking
<ol><li>Wählen Sie eine geeignete Verdünnung Ihres Zielorganismus aus. Beispielsweise ergibt Lösung4 eine 1/10.000. Verdünnung Ihrer Anfangskonzentration. Typischerweise werden Verdünnungen von 1/1.000th (T3/Lösung), 1/1.000.000th (T6/Lösung6) und 1/1,000,000,000th (T9/Lösung9) ausgewertet, um Mikroben aufzuzählen.</li>
	<li>Mit einer sterilen Einweg-Impfschleife aus Kunststoff oder einer wiederverwendbaren Metall-Impfschleife, die seit nicht weniger als 10 Sekunden unter Beschuss steht, tauchen Sie ab Schritt 5 in die gewünschte Lösung ein. Kalibrierte Impfschleifen sollten 0,01 ml übertragen. (Achtung: Lassen Sie nicht zulassen, dass geflammte Schleife Bakterien sofort nach dem Entfernen von der Hitze kontaktieren)</li>
	<li>Die Petrischalenabdeckung auf einer Seite leicht anheben, so dass nur die Impfschlaufe auf den Agar zugreifen kann. Gleiten Sie die Impfschleife über die Oberseite der Medien in einer Zick-Zack-Manier, um darauf zu achten, den Agar nicht zu kompromittieren. Senken Sie den Petrischalendeckel.</li>
	<li>Verwenden Sie eine neue Einweg-Impfschleife oder sterilisieren Sie Ihre wiederverwendbare Schleife erneut.</li>
	<li>Drehen Sie die Platte um etwa 1/3rd (ca. 118°) und reduzieren Sie die Frequenz der Zick-Zack-Bewegung.</li>
	<li>Verwenden Sie erneut eine neue Einwegschleife oder sterilisieren Sie eine Metallschleife, bevor Sie sich ein letztes Mal drehen, und reduzieren Sie die Zick-Zack-Frequenz erneut. Senken Sie den Petrischalendeckel.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 7.2 - 7.6, bis mindestens drei Petrischalen für drei verschiedene Verdünnungen gestreift wurden, indem sie eine neue Einwegschleife verwenden oder eine wiederverwendbare Schleife erneut entzünden (Abbildung 2).</li>
	<li>Die gestreiften Petrischalen über Nacht in einen 37°C-Inkubator geben. Für anaerobe Organismen verwenden Sie eine anerobische Kammer.</li>
</ol>8. Datenanalyse und Ergebnisse
<ol><li>Kulturen wurden aus den oxischen und anoxischen Zonen einer 7-tägigen Winogradsky-Säule geerntet. Diese Zonen eignen sich für heterotrophe bzw. eisenoxidierende Anaeraare.</li>
	<li>Säulenexplants wurden vor dem Streichen oder Ausbreiten auf LB Agar-Platten seriell verdünnt.</li>
	<li>Streaking ergab eine gemischte Population aus jeder der bewerteten Winogradsky-Zonen. Streuplatten führten zu ähnlichen Ergebnissen.</li>
	<li>Um KBE/ml oder KBE/g zu berechnen, durchschnittlich die Anzahl der gezählten Kolonien aus drei Platten. Multiplizieren Sie die durchschnittliche Anzahl der Kolonien mit dem Verdünnungsfaktor und dividieren Sie durch den Betrag aliquoted. Wenn beispielsweise durchschnittlich 65 Kolonien auf Platten gezählt würden, die mit 0,1 ml Lösung6 (T6) geimpft wurden, würde die zuvor beschriebene Formel 650.000.000 KBE/ml entsprechen.</li>
	<li>Isolierte Kolonien können nun aus jeder Platte ausgewählt werden, um sie in Anreicherungstests zu verwenden, um die Artenidentität zu bestimmen.</li>
</ol>

Die bakterielle Aufzählung und Dehnungsisolierung durch Beschichtung erfordert überschaubare Konzentrationen von Zielorganismen. Eine erfolgreiche Beschichtung ist daher von einer seriellen Verdünnung abhängig. Daher bleiben die genannten Techniken der Eckpfeiler der mikrobiologischen Untersuchung und des Experimentierens. Obwohl einfach durch design, Verdünnungsfaktoren und Beschichtungstechnik kann durch den Experimentator geändert werden, um die Ergebnisse zu stärken, ohne die Integrität jeder Methode zu beeinträchtigen. Das Plotten der vier Phasen des bakteriellen Wachstums kann hilfreich sein, wenn sie gewünschte Mikroben charakterisieren. Diese Phasen, Verzögerung, Protokoll, stationär und Tod, sind durch Veränderungen in der bakteriellen Replikation gekennzeichnet. Die Verzögerungsphase zeichnet sich durch ein langsames Wachstum aufgrund physiologischer Anpassung aus, die Logphase ist die Periode der maximalen Proliferation mit einem exponentiellen Anstieg lebensfähiger Zellen, stationäre Phase wird dann aufgrund von Umwelteinschränkungen und Ansammlungen von Toxinen erreicht. vor der Todesphase, in der die Zellzahl zu sinken beginnt. Dies kann durch serielle Verdünnung (oder 1-stufige Verdünnung, um Verwechslungen zu vermeiden) Lösung0 jede Stunde für insgesamt 8 Stunden erreicht werden, beginnend mit Zeit0 (Lösung0 sollte nach jeder Verdünnung an einen Schüttel-Inkubator zurückgegeben werden). Berechnen Sie das Protokoll10 der KBE/ml für ein einzelnes Verdünnungszeichen von Zeit0 und Plot auf der Y-Achse. Wiederholen Sie diese Berechnung für die Stichprobe Zeit1 (stellen Sie sicher, dass CFU/ml mit dem gleichen Verdünnungsfaktor wie Zeit0berechnet werden). Wiederholen Sie dies, bis jedes Mal (Zeit1-Zeit8) auf der X-Achse geplottet wird.

serielle verdünnungen und ausplattieren: auszählung von mikrobiom

Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration

Quelle: Jonathan F. Blaize1, Elizabeth Suter1, und Christopher P. Corbo1 1 Department of Biological Sciences, Wagner College, 1 Campus Road, Staten Island NY, 10301
Die quantitative Bewertung von Prokaryoten kann angesichts ihres Überflusses, ihrer Neigung zur exponentiellen Proliferation, der Artenvielfalt innerhalb einer Population und der spezifischen physiologischen Bedürfnisse belastend sein. Diese Herausforderung verschlimmert sich in der vierphasigen Natur, in der sich Bakterien vermehren (Lag, Log, stationär und Tod). Die Fähigkeit, die Konzentration von Mikroorganismen genau abzuschätzen, ist für eine erfolgreiche Identifizierung, Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung erforderlich (6). Daher haben Mikrobiologen seit über einem Jahrhundert serielle Verdünnungs- und verschiedene Beschichtungstechniken eingesetzt, um die bakterielle und virale Belastung in klinischen, industriellen, pharmazeutischen und akademischen Laborumgebungen zuverlässig zu quantifizieren (2,4,6). Beschreibungen dieser Methode erschienen erstmals 1883, als der deutsche Wissenschaftler und Arzt Robert Koch seine Arbeit über infektionserregende Erreger veröffentlichte (2). Kochs vorgenannte Techniken, die oft als Vater der modernen Bakteriologie bezeichnet werden, sind weltweit zum Goldstandard für die Aufzählung von Mikroorganismen geworden, die kultivierbar oder nicht mehr sind.
Serielle Verdünnung ist eine systematische Reduktion einer bekannten oder unbekannten Einheit (ein Gelöster, Organismus usw.) durch sukzessive Wiedersuspension einer Ausgangslösung (Lösung0) in feste Volumina eines flüssigen Verdünnungsmittels (Rohlinge). Diese Rohlinge bestehen in der Regel aus 0,45% Saline, obwohl die Zusammensetzung variiert werden kann (7). Während ein Experimentator ein beliebiges Volumen für jedes Verdünnungsmittel auswählen kann, ist es meistens ein Vielfaches von 10, was eine logarithmische Reduktion der Probe erleichtert. Beispielsweise enthält Lösung0 insgesamt 100 E. coli-Zellen, die in 10 ml Nährstoffbrühe suspendiert sind. Wenn 1 ml Lösung0 entfernt und zu 9 ml Saline (Verdünnungsstoff1)hinzugefügt wird, würde die neue Lösung (Lösung1) 1/10der Anfangskonzentration von E. colienthalten. In diesem Beispiel würde die neue Lösung (Lösung1) 10 E. coli-Zellen enthalten. Eine Wiederholung dieses Prozesses durch Entfernen von 1 ml Lösung1 und Hinzufügen zu weiteren 9 ml Saline (Verdünnungsmittel2) würde Lösung2ergeben, die nur eine einzelne E. coli-Zelle enthält. Da jede neue Lösung (9 ml Verdünnungsstoff + 1 ml Lösung) insgesamt 10 ml enthält, können wir schlussfolgern, dass der Verdünnungsfaktor für diese Reduktion 10 beträgt oder dass es sich um eine 10-fache serielle Verdünnung handelte (Abbildung 1). Da wir in diesem Beispiel erst mit 100 Zellen begonnen haben und wir um den Faktor 10 verdünnen, sind nur zwei Schritte erforderlich, um die absolute Mindestkonzentration von 1 Zelle zu erreichen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10507/10507fig1.jpg"> Abbildung 1: Serielle Verdünnung einer Lagerlösung. Ein 1 ml Aliquot der Stammlösung (Lösung0) wird zu Tube 1 hinzugefügt, die 9 ml mit 0,45% Salzsalze (dilent1)enthält; das Produkt dieser Mischung ist Lösung1. Wiederholen Sie dies, indem Sie 1 ml der neu erstellten Lösung1 aliquotieren und zu Tube 2 hinzufügen. Die Aliquotierung und Resuspension setzt sich auf diese Weise fort, bis die endgültige Röhre erreicht ist, wodurch die Lagerkonzentration mit jedem Schritt um den Faktor 10 verwässert wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10507/10507fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Serielle Verdünnung ist die einfachste Technik zur Erzielung überschaubarer Konzentrationen eines gewünschten Organismus und wird durch Petrischalenstreifen und -streuungen ergänzt, nur zwei von vielen Beschichtungstechniken, die von Mikrobiologen verwendet werden. Dieser Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass der Experimentator reine Stämme einer einzelnen Art oder separate Stämme von einer gemischten Population ernten kann (7). Streaking wird durch die Einführung eines Organismus in ein festes Medium (in der Regel bestehend aus Agarose) erreicht, auf dem er wachsen wird, wenn die entsprechenden Nährstoffe verfügbar sind. Das sanfte Schwenken einer sterilen Impfschleife über das Medium (so dass ein subtiler Streifen bleibt) in einem starren sinusförmigen Muster verteilt den Organismus proportional zur Frequenz der Wellenform des Experimentators. Die Aufteilung der Petrischale in Drittel oder Viertel (Quadrantstreifen) und die Verringerung der Häufigkeit jedes Streifens, wenn eine neue Region der Schale eingegeben wird, wird die Anzahl der Mikroorganismen, die diese Region besetzen können, allmählich reduzieren und einzelne Kolonien anstelle einer nicht quantifizierbaren bakteriellen Rasen. Die Streubeschichtung verdünnt die Proben nicht zusätzlich; ein steriler Glasstreuer wird verwendet, um ein Aliquot von Suspensionsmedien über eine ganze Petrischale zu verteilen (Abbildung 2). Die Kolonien, die auf der Streuplatte wachsen, entstehen aus einer einzigen Zelle und jede Kolonie auf der Schale kann gezählt werden, um die Anzahl der koloniebildenden Einheiten pro Milliliter (KBE) in einer gegebenen Suspension zu schätzen, dargestellt als KBE/ml (6) (Abbildung 3) Weicher Agar und Nachbau Beschichtungen sind Variationen der oben genannten Techniken und ermöglichen die Isolierung von Bakteriophagen bzw. Mutantenscreening (1,7).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10507/10507fig2.jpg"> Abbildung 2: Plattenstreifen für bakterielle Aufzählung und Dehnungsisolierung. Beschriften Sie den Boden einer Petrischale mit Identifikationsinformationen (Bakterienname, Datum, Medien) und teilen Sie sie in Drittel auf. Nach der Auswahl einer geeigneten Verdünnung der Stammprobe eine sterile (Einweg- oder Flammen)-Impfschleife nehmen und das Reagenzglas untertauchen (hier, T3). Die Petrischalenabdeckung auf einer Seite leicht anheben, so dass nur die Impfschlaufe auf den Agar zugreifen kann. Gleiten Sie die Impfschleife über die Oberseite der Medien in einer Zick-Zack-Manier, um darauf zu achten, den Agar nicht zu kompromittieren. Drehen Sie die Platte um etwa 1/3rd (ca. 118°) und reduzieren Sie die Frequenz der Zick-Zack-Bewegung. Drehen Sie ein letztes Mal und reduzieren Sie die Zick-Zack-Frequenz noch einmal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10507/10507fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10507/10507fig3.jpg"> Abbildung 3: Streubeschichtung. 1 g der Aerobic-Zone wurde in T1 resuspendiert und dann seriell verdünnt. Ein steriler Glas- oder Kunststoff-Einweg-Streustab wird verwendet, um Inoculum in jeder Schale zu verteilen. Dies wurde mit 1 g der anaeroben Zone wiederholt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10507/10507fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Wie bei seriellen Verdünnungen wird eine logarithmische Skala verwendet, um die Konzentration des Organismus auszudrücken. Die Anzahl der Kolonien, die in Standard-Petrischalen mit einer Größe von 100 mm x 15 mm angebaut werden, kann manuell (oder automatisiert mit Hilfe der Computerverarbeitung) aufgezählt werden, indem isolierte Wachstumscluster identifiziert werden. Zählt, die insgesamt weniger als 30 oder mehr als 300 wert sind, sollten als zu wenig zum Zählen (TFTC) oder zu zahlreich für die Anzahl (TNTC) definiert werden. Im letzteren Fall sollte eine serielle Verdünnung durchgeführt werden, um die Konzentration zu reduzieren, bevor eine neue Petrischale wieder aufgelegt wird. Die Mittelung der Anzahl der in sich geschlossenen Kolonien, die aus drei getrennten Petrischalen identifiziert wurden, und multiplizierte den Mittelwert mit dem Verdünnungsfaktor ergibt CFU/ml; Das Zeichnen des Protokolls10 von KFU/ml gegen die Zeit wird die mittlere Erzeugungszeit des Organismus offenbaren (7).

Serielle Verdünnungen und Ausplattieren: Auszählung von Mikrobiom

Source: Jonathan F. Blaize1, Elizabeth Suter1, and Christopher P. Corbo1
1 Department of Biological Sciences, Wagner College, 1 Campus Road, Staten Island ...

Um Bakterien zu identifizieren und zu untersuchen, müssen wir sie manchmal zuerst aus einer Probe isolieren und anreichern. Zum Beispiel sind Proben, die aus einer Winogradsky-Säule gewonnen werden, gemischt, was bedeutet, dass sie mehrere Arten oder Stämme von Bakterien enthalten, so dass die Untersuchung eines einzelnen Bakteriums oder die Aufzählung der verschiedenen vorhandenen Arten eine Herausforderung sein kann. Zu diesem Zweck werden in der Regel serielle Verdünnungs- und Plattierungstechniken eingesetzt, um die Bakterienlast zuverlässig zu quantifizieren und einzelne Kolonien zu isolieren. Die serielle Verdünnung ist ein Prozess, bei dem die Konzentration eines Organismus, in diesem Beispiel Bakterien, durch sukzessive Resuspension in festen Volumina des flüssigen Verdünnungsmittels systematisch reduziert wird. Normalerweise ist das Volumen des Verdünnungsmittels ein Vielfaches von 10, um die logarithmische Reduktion des Probenorganismus zu erleichtern. Zum Beispiel wird zunächst ein Gramm Sediment aus der interessierenden Winogradsky-Zone entnommen und 10 Millilitern eines geeigneten flüssigen Mediums zugesetzt. Dann wird ein Milliliter dieser ersten Verdünnung in ein anderes Röhrchen mit neun Millilitern Medium gegeben. Der Vorgang kann so lange wiederholt werden, bis mehrere verschiedene Konzentrationen von Bakterien hergestellt wurden. Die serielle Verdünnung ist in diesem Beispiel der Schlüssel zur Zählung von Bakterien, da gemischte Proben aus einer Winogradsky-Säule eine unbekannte, oft große Anzahl von Bakterien enthalten. Als nächstes ermöglichen die Streifenbeschichtung und die Spread-Beschichtung die Isolierung bzw. Zählung von Bakterien innerhalb einer Probe. Das Schlieren wird erreicht, indem eine verdünnte Probe in einen Abschnitt des festen Mediums eingebracht wird, der mit Nährstoffen versetzt und in Drittel geteilt wird. Dieses Inokulum wird dann in einem Zick-Zack-Muster über jedes Drittel der Platte verteilt. Da verschiedene Abschnitte der Platte gestreift sind und sich nur einmal von der vorherigen Probe kreuzen, wird die Probe dünner verteilt. Das bedeutet, dass Sie möglicherweise nur von einer Verdünnung streichen müssen, um in den späteren Abschnitten einzelne Völker zu erhalten. Nach der Inkubation ermöglichen die gestreiften Platten Beobachtungen der Morphologie der Kolonie, Informationen, die bei der Unterscheidung zwischen verschiedenen Bakterienarten helfen können. Alternativ, wenn das Hauptziel die Aufzählung der Bakterien in der Probe ist, kann eine Plattierung verwendet werden. Bei der Aufstrichplattierung wird ein Aliquot einer einzelnen Probe gleichmäßig über die gesamte Oberfläche eines festen Mediums verteilt. Da wir die Bakterienzahlen in der gemischten Probe nicht kennen, wird in der Regel für jede der Verdünnungen oder eine repräsentative Probe davon eine Spreizplatte erstellt. Nach der Inkubation kann die Aufzählung mit diesen Spread-Platten durchgeführt werden. Alle Platten mit einer Koloniezahl von weniger als 30 sollten verworfen werden, da kleine Zählungen einem größeren Fehler unterliegen. Ebenso sollten alle Zählungen über 300 verworfen werden, da die Überfüllung und Überlappung der Kolonien zu einer Unterschätzung der Koloniezahl führen kann. Wenn die Koloniezahlen jeder dieser verbleibenden Schalen aufgezeichnet und mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert und dann durch das plattierte Volumen dividiert werden, ergibt sich die koloniebildende Einheit oder KBE pro Milliliter Suspension. In diesem Video erfahren Sie, wie Sie eine Probe, die ein bekanntes Bakterium enthält, und die mikrobiellen Gemeinschaften, die in verschiedenen Regionen einer Winogradsky-Säule enthalten sind, durch serielle Verdünnung, Spread-Plating und Streak-Plating qualitativ und quantitativ auswerten. Ziehen Sie zunächst eine geeignete persönliche Schutzausrüstung an, z. B. einen Laborkittel, Handschuhe und eine Schutzbrille. Als nächstes sterilisieren Sie den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol und wischen Sie die Oberfläche ab. Als nächstes werden zwei 500-Milliliter-Erlenmeyerkolben gesammelt und eine Brühe und der andere Agar beschriftet. Zur Herstellung der LB-Agar-Lösung mischen Sie etwa 6,25 Gramm LB-Agar, drei Gramm technischen Agar und 250 Milliliter destilliertes Wasser in dem mit dem Kolben beschrifteten Agar. Bereiten Sie dann LB-Brühe zu, indem Sie 2 kombinieren. 5 g LB-Medium und 100 Milliliter destilliertes Wasser in den mit Kolben beschrifteten Brühe. Nehmen Sie die Kolben nach dem Autoklavieren mit einem hitzebeständigen Handschuh aus dem Autoklaven und legen Sie sie in ein 40 bis 50 Grad Celsius heißes Wasserbad. Sobald die Kolben 50 Grad Celsius heiß sind, bereiten Sie vorsichtig drei 100-Milliliter-Aliquots der Brühelösung vor und beschriften Sie jede Aliquotlösung mit Null. Sammeln Sie als Nächstes 10 sterile Petrischalen und beschriften Sie sie mit dem Datum, dem Namen, der Art des verwendeten Mediums und der Winogradsky-Säulenzone, aus der die Organismen geerntet werden. Pipettieren Sie 15 Milliliter Agar aus dem Agarkolben in jede Petrischale. Verwenden Sie dann die Pipettenspitze, um alle Blasen zu entfernen, setzen Sie die Plattendeckel wieder auf und lassen Sie sie über Nacht auf der Tischplatte festigen. Wischen Sie am nächsten Tag die Arbeitsplatte mit 70% Ethanol ab. Beschriften Sie anschließend 10 20-Milliliter-Reagenzgläser T1 bis T10 und legen Sie sie in ein Rack. Pipettieren Sie neun Milliliter 0,45% Kochsalzlösung in jedes Röhrchen. Decken Sie nun jedes der 10 Reagenzgläser locker mit ihren Kappen ab und geben Sie sie in ein autoklaventaugliches Reagenzglasgestell. Entfernen Sie nach Beendigung des Zyklus die Kochsalzrohlinge mit hitzebeständigen Handschuhen und lassen Sie sie abkühlen. Lagern Sie die Röhrchen bei Raumtemperatur, bis sie ca. 22 Grad Celsius erreicht haben. Um einen bekannten Zielorganismus, in diesem Beispiel E. coli, zu kultivieren, inokulieren Sie 100 Milliliter Lösung Null mit einer einzigen Kolonie aus einer zuvor gestreiften Platte. Decken Sie dann das Röhrchen ab und inkubieren Sie es über Nacht bei 37 Grad Celsius. Um die Regionen einer Winogradsky-Säule zu bewerten, fügen Sie etwa ein Gramm Material aus der aeroben Zone zu T1 hinzu und resuspendieren Sie es durch Vortexing. Wiederholen Sie dann diesen Vorgang mit einem Gramm Material aus der anaeroben Zone. Nehmen Sie das Röhrchen mit der mit E. coli geimpften Lösung Null aus dem Inkubator und schütteln Sie es. Pipettieren Sie dann einen Milliliter der Lösung in ein T1-Reagenzglas und wirbeln Sie sie zum Mischen. Entfernen Sie einen Milliliter Lösung aus T1 und überführen Sie ihn in T2, wobei Sie ihn zum Mischen vortexen. Wiederholen Sie diesen Vorgang durch das Rohr T10. Um die aeroben und anaeroben Zonen der Winogradsky-Säule zu bewerten, entnehmen Sie jeweils einen Milliliter Lösung aus jedem der zuvor vorbereiteten T1-Röhrchen und überführen Sie sie in die entsprechenden T2-Röhrchen. Setzen Sie dann die seriellen Verdünnungen durch die T10-Röhrchen fort, wie zuvor gezeigt. Zum Verteilen der Platte pipettieren Sie 100 Mikroliter der verdünnten Probe aus jedem T3-Röhrchen auf die entsprechende Petrischale. Verwenden Sie dann einen sterilen Spreizstab, um die Probe vorsichtig auf die Petrischale zu verteilen, und setzen Sie den Plattendeckel wieder auf. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die Verdünnungen T6 und T9, wie zuvor gezeigt. Inkubieren Sie die Platten mit aeroben Organismen in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator für 24 Stunden. Inkubieren Sie die Platten mit anaeroben Organismen in einer anaeroben Kammer bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden. Am nächsten Tag nehmen Sie die Verdünnungsplatten T3, T6 und T9 aus dem Inkubator und der Anaerobkammer und bringen sie auf die Tischplatte. Arbeiten Sie mit einer Platte nach der anderen und gleiten Sie mit einer sterilen Impfschlaufe in einem Zick-Zack-Muster über die Oberseite des Mediums. Setze dann den Deckel der Petrischale wieder auf. Drehen Sie anschließend die Platte um 1/3 und sterilisieren Sie die Schlaufe, um die Häufigkeit des zuvor erstellten Zick-Zack-Musters zu reduzieren. Drehen Sie die Platte nach dem Sterilisieren der Schlaufe erneut um 1/3, reduzieren Sie die Häufigkeit des Zick-Zack-Musters ein letztes Mal und setzen Sie den Deckel wieder auf. Wiederholen Sie diese Streifenmethode für die restlichen Platten, wie zuvor gezeigt. Legen Sie dann die gestreiften Platten mit aeroben Organismen über Nacht in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator und die gestreiften Platten mit anaeroben Organismen über Nacht in eine anaerobe Kammer, die auf 37 Grad Celsius eingestellt ist. Die Kulturen wurden aus den aeroben und anaeroben Zonen einer siebentägigen Winogradsky-Säule geerntet. Dann wurden die Kulturen seriell verdünnt, bevor sie auf LB-Agarplatten schlieren und sich ausbreiten. Die Streifenbildung ergab eine gemischte Population aus jeder der untersuchten Winogradsky-Zonen, und die Spreizplatten lieferten ähnliche Ergebnisse. Eine Platte, die aus einer gemischten Population stammt, führt zu Bakterienkolonien in unterschiedlichen Formen, Größen, Texturen und Farben. Im Gegensatz dazu zeigten die Streifen- und Spreizplatten, die den bekannten Organismus E. coli enthielten, eine homologe Population. Im Allgemeinen ist es am besten, die KBE pro Milliliter anhand der durchschnittlichen Koloniezahl von drei Platten zu berechnen, die mit der gleichen Probe und dem gleichen Verdünnungsfaktor verteilt sind. Multiplizieren Sie die durchschnittliche Anzahl der Kolonien mit dem Verdünnungsfaktor und dividieren Sie durch die aliquotierte Menge. Schließlich können isolierte Kolonien, die aus jeder Platte ausgewählt wurden, in weiteren Anreicherungsassays verwendet werden, um die Artidentität zu bestimmen.

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counting bacteria with dilution plates

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs.

Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed volume of diluent, or blank, such as 0.45% saline. When 1 mL is transferred into 9 mL of saline, the sample is diluted 10-fold. Repeating that step again lowers the concentration even more, and only two steps are needed in the example of 100 E. coli cells to reach a single cell.

Plating methods help separate microorganisms and make colonies visible. Streaking uses a sterile inoculating loop on agar, a solid growth medium, to spread cells across the plate. In a quadrant streak, the plate is divided into thirds or fourths, and each new area is streaked less often so fewer cells land there. This can produce single colonies instead of a bacterial lawn and can help isolate a pure strain from a mixed sample.

Spread plating uses a sterile glass spreader to distribute an aliquot over the whole petri dish. This method does not add another dilution step. The colonies that grow are counted as colony forming units, or CFU, which are reported as CFU/mL. Soft agar and replica plating are related methods. They can be used for bacteriophage isolation and mutant screening.

Colony counts are usually done on standard 100 mm by 15 mm petri dishes. Isolated colonies can be counted by hand or with computer tools. Plates with fewer than 30 colonies are too few to count, or TFTC. Plates with more than 300 colonies are too numerous to count, or TNTC. If a plate is TNTC, another serial dilution should be done before restreaking a new plate.

To estimate CFU/mL, scientists average the number of colonies from three separate plates and multiply by the dilution factor. The same log scale used in dilution work also helps show how organism concentration changes over time. Plotting log10 CFU/mL against time can reveal the mean generation time of the organism.

Counting Bacteria with Dilution Plates

creating a winogradsky column: a method to enrich the microbial species in a sediment sample

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Winogradsky Column Microbial Layers and Gradients

A Winogradsky column shows how microbial layers form in mud and water over time. It is a clear, enclosed ecosystem that helps scientists grow sediment microbes that are hard to culture in a test tube or on a petri dish. By keeping conditions close to a microbe’s natural habitat, the column makes it possible to study organisms that help drive Earth’s biogeochemical cycles. The column is built from pond or wetland sediment mixed with water in a transparent container. Extra sources of carbon,...

serial dilutions and plating: microbial enumeration

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs. Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed...

enrichment cultures: culturing aerobic and anaerobic microbes on selective and differential medias

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Selective Media for Bacterial Isolation

Selective media help scientists isolate bacteria by supporting some microbes and blocking others. This lab also uses differential media, which reveal a visible chemical trait in the organism being grown. Together, these methods help identify bacteria from mixed samples. Prokaryotic cells live in almost every environment on Earth. They also show wide metabolic diversity, so the growth medium must supply the molecules they need for energy. Some microbes are extremophiles, meaning they live in...

pure cultures and streak plating: isolation of single bacterial colonies from a mixed sample

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Streak Plate Method for Isolating Bacteria

The streak plate method is used to isolate single bacterial colonies from a mixed sample. It helps separate one bacterial type from another so a pure culture can be grown. This is important in both clinical and research settings, where bacteria often grow together in mixed cultures. Pure cultures are needed for later genetic and protein studies. They are also used to check whether a sample is pure and to identify infectious agents from clinical samples. Because different strains can affect...

16s rrna sequencing: a pcr-based technique to identify bacterial species

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Bacterial ID with 16S rRNA Gene Sequencing

Bacterial identification with 16S rRNA gene sequencing helps scientists tell bacterial species apart. It is used in microbial ecology to study biodiversity in environmental samples and in medical microbiology to help diagnose infected patients. Traditional methods include microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays. Molecular methods have changed how bacteria are identified. 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing is often faster...

growth curves: generating growth curves using colony forming units and optical density measurements

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Bacterial Growth Stages and Cell Counts

Bacterial growth stages and cell counts show how a culture changes over time. This page follows a batch culture as it moves through lag, exponential, stationary, and death phases. It also shows how colony forming units, or CFU, and optical density can be used to measure that growth. Lag phase is the time bacteria need to adjust to a new environment before fast division begins. During exponential phase, cells grow and divide at the fastest rate, and DNA replication, RNA transcription, and...

antibiotic susceptibility testing: epsilometer tests to determine mic values of two antibiotics and evaluate antibiotic synergy

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Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform. The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with...

microscopy and staining: gram, capsule, and endospore staining

microscopy-and-staining-gram-capsule-and-endospore-staining

Bacterial Stains for Cell Walls and Spores

Bacterial stains help scientists see cell walls, capsules, and endospores with a compound light microscope. Many bacteria are hard to tell apart with light alone because they are small, colorless, and can look similar under the lens. Staining makes these hidden features visible and helps identify different bacteria. A compound microscope uses more than one lens to magnify a sample. Its objective lens collects light near the specimen, and the eyepiece enlarges the image. Many compound...

plaque assay: a method to determine viral titer as plaque forming units (pfu)

plaque-assay-method-to-determine-viral-titer-as-plaque-forming-units

Phage Plaque Test for Counting Viruses

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect prokaryotic cells. The plaque assay is a classic way to count these viruses by measuring viral titer, which is the amount of virus in a sample. It was first described in 1952 and is still one of the most reliable methods for determining viral titer. Phages were identified in the early 20th century by Twort and d'Hérelle. They have since been recognized for their therapeutic value and for their role in human and global ecosystems. Interest in...

transformation of e. coli cells using an adapted calcium chloride procedure

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Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency. Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation.

conjugation: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

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Bacterial Gene Transfer by Conjugation in E. coli

Bacterial conjugation is a form of horizontal gene transfer in E. coli that moves DNA from one cell to another through direct contact. It was first discovered by Lederberg and Tatum in 1946. Unlike transformation or transduction, conjugation is a natural, one-way transfer of DNA from a donor cell to a recipient cell. This process can increase bacterial genetic diversity. It is often described as a type of bacterial mating. It has also helped drive the spread of antibiotic-resistant bacteria.

phage transduction: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

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Using P1 Phage to Move Antibiotic Resistance in E. coli

Bacteriophage transduction moves DNA between bacteria by using a phage, or bacterial virus, as the carrier. In this process, a phage can deliver genetic material from one bacterium to another. The method is a form of horizontal gene transfer and is important in both bacterial evolution and laboratory genetics. Phages were first described in the early 1900s, and transduction was named in 1951 by Norton Zinder and Joshua Lederberg. The transcript describes two main phage classes. Lytic phages...

microbiology

Diese Sammlung zeigt die wichtigsten Werkzeuge der mikrobiologischen Forschung, einschließlich steriler Arbeitstechniken und Ausplattierung, der Verwendung von selektiven Medien und Anreicherung von Proben sowie Kultivierungsmethoden für gemischte oder reine Proben. Darüber hinaus werden gängige Methoden zur Identifizierung von mikrobiellen Isolaten sowie Verfahren zur genetischen Manipulation von Bakterien gezeigt.

Learn how serial dilution, streaking, and spread plating help scientists count bacteria, isolate colonies, and estimate CFU/mL in lab samples.

Counting Bacteria with Dilution Plates

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