Name: measuring bacterial resistance with e-tests
Uploaded: 2023-04-30T07:10:10.000Z
Duration: 13 min 39 s
Channel: JoVE

K12 Standards

Louisiana Student Standards for Science

High School

Life Sciences

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From Molecules To Organisms: Structures And Processes

HS-LS1-8

antibiotic-susceptibility-testing-epsilometer-tests-to-determine-mic

Antibiotic Susceptibility Testing: Epsilometer Tests to Determine MIC Values of Two Antibiotics and Evaluate Antibiotic Synergy

1. Epsilometer-Tests (E-Tests)
<ol><li>
gliederung
	<ol>
<li>Handschuhe und laborator</li>
		<li>Bereiten Sie den Arbeitsplatz bereit, indem Sie ihn mit 70% Ethanol sterilisieren</li>
		<li>Sammeln Mueller-Hinton Agar Platten (MHA Platten)</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung eines McFarland Trübungsstandards Nr. 0,5
	<ol>
<li>Bereiten Sie eine 1%ige Lösung von Bariumchlorid (BaCl2) vor: 1 Gramm wasserfreies Bariumchlorid (BaCl2) in 100 ml destilliertes Wasser geben. Wirbel gut.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 1% Lösung von Schwefelsäure (H2SO4): 1 ml konzentriertesH2SO4 in 99 ml destilliertem Wasser hinzufügen. Wirbel gut.</li>
		<li>Vorbereiten eines McFarland Trübungsstandards Nr. 0.5: 50 l BaCl2 Lösung in 5 ml 1%H2SO4 Lösung. Wirbel die Lösung gut, um eine trübe Suspension zu erhalten.</li>
		<li>Halten Sie McFarland Trübungsstandard Nr. 0.5 in einem folienbedeckten Rohr. Bei 25°C maximal 6 Monate lagern. Vortex gut zu einer homogenen Lösung vor dem Gebrauch.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung von MHA-Platten
	<ol>
<li>Scrape Streptococcus Gruppe G Bakterien aus Blut Agar Platte mit einer sterilen Schleife. Mischen Sie in 1ml von Saline, und Wirbel zu einer Suspension der Bakterien.</li>
		<li>Vergleichen Sie die Suspension mit einem McFarland-Standard Nr. 0.5, um die gleiche Trübung zu erreichen, um während der Experimente die gleiche Inokulumgröße zu haben. Passen Sie die Konzentration entweder mit zusätzlicher Saline oder Bakterien an.</li>
		<li>Impfen Sie die MHA-Platten mit einem sterilen Baumwoll-Kippapplikator. Wischen Sie die Platte sanft, um die Oberfläche zu bedecken. Fahren Sie mit einer der drei unten beschriebenen Methoden fort (1.4-1.6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Einzelantibiotika-Resistenztest. Streptokokken Gruppe G, Widerstand gegen Penicillin G oder Gentamicin <ol>
<li>Legen Sie einen E-Teststreifen (entweder Penicillin G oder Gentamicin) in die Mitte der MHA-Platte (Abbildung 1 A,B).</li>
		<li>18-20 Stunden, 37°C inkubieren.</li>
		<li>Lesen Sie die Ergebnisse. MIC wird als Hemmungszone gemessen, die den abgestuften Antibiotika-Teststreifen schneidet (Abbildung 1 C,D).</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig1.jpg"> Abbildung 1: Einzel-E-Test. Platzierung eines E-Teststreifens von A) Penicillin G und B) Gentamicin auf einer Mueller Hinton Agarplatte, die mit Bakterienkolonien einer Gruppe G Streptokokken vor (A und B) und nach (C und D) über Nacht bedeckt ist Inkubation bei 37°C 5%CO2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<ol start="5"><li>
Synergie-Test-Cross-Ansatz. Streptococcus Gruppe G, Widerstand gegen Penicillin G und Gentamicin.<ol>
<li>Legen Sie zwei E-Teststreifen mit verschiedenen Antibiotika (z.B. Penicillin G und Gentamicin) in einer Kreuzformation auf die geimpfte MHA-Platte.<ol>
<li>Um die genauesten Ergebnisse zu erzielen, zielen Sie darauf ab, das Kreuz in einem Winkel von etwa 90° am Schnittpunkt zwischen den Skalen bei ihren MIC-Werten zu platzieren, der zuvor auf einem einzigen Antibiotikaresistenztest ermittelt wurde (Abbildung 2 A).</li>
			<li>Beachten Sie, dass die Streifen, sobald sie auf die Agarplatte gelegt wurden, nicht bewegt werden sollten, da einige Antibiotika möglicherweise bereits von der Platte absorbiert wurden. Daher ist es besser, die Streifen in einem leicht falschen Winkel (z.B. 85°) und bis zu 1-2 mm vom tatsächlichen MIC-Wert zu halten. Es wird empfohlen, das Experiment in Dreifacharbeit durchzuführen, um dieses Problem zu reduzieren.</li>
		</ol>
</li>
		<li>18-20 Stunden, 37°C inkubieren.</li>
		<li>Lesen Sie die Ergebnisse. MIC wird als Hemmungszone gemessen, die den abgestuften Antibiotika-Teststreifen auf jedem e-Teststreifen schneidet (Abbildung 2 B).</li>
		<li>Verwenden Sie die Formel für die fraktionelle hemmende Konzentration (FIC) (Gleichung 1), um Synergien zu bestimmen.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig2.jpg"> Abbildung 2: Synergismus-Erkennung - Kreuztest. Ergebnisse der antimikrobiellen Synergietests von MIC von Penicillin G und Gentamicin auf Streptococcus Gruppe G vor (A) und nach (B) Inkubation über Nacht bei 37°C 5%CO2. Zwischen den beiden einzelnen MIC-Werten wird ein 90°-Winkel gebildet (Penicillin G: 0,094 g/ml, Gentamicin: 8 g/ml). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<ol start="6"><li>
Synergy-Test-Non-Cross-Ansatz. Streptococcus Gruppe G, Widerstand gegen Penicillin G und Gentamicin.<ol>
<li>Platzieren Sie den E-Teststreifen in der Mitte der MHA-Platte (Abbildung 3 A,D).</li>
		<li>Markieren Sie, wo sich der zuvor ermittelte MIC-Wert auf jedem Streifen befand.</li>
		<li>1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Entsorgen Sie den E-Teststreifen für jede MHA-Platte (Abbildung 3 B,E).</li>
		<li>Platzieren Sie den zweiten E-Teststreifen (der ein anderes Antibiotikum enthält) auf den Bereich des zuvor entfernten Streifens, so dass ihre MIC-Werte der Marke entsprechen und ausgerichtet sind.</li>
		<li>18-20 Stunden, 37°C inkubieren.</li>
		<li>Lesen Sie die Ergebnisse. MIC wird als Hemmungszone gemessen, die den abgestuften Antibiotika-Teststreifen auf jedem e-Teststreifen schneidet (Abbildung 3 C,F).</li>
		<li>Zur Bestimmung der Synergie wird die Formel für die fraktionelle hemmende Konzentration (FIC) verwendet (Gleichung 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig3.jpg"> Abbildung 3: Synergismus-Erkennung - Nicht-Kreuztest. Ergebnisse der antimikrobiellen Synergietests von MIC von Penicillin G und Gentamicin auf Streptococcus Gruppe G. A) Gentamicin-Streifen (8 g/ml zentriert) auf der Oberseite der Streptococcus-Gruppe G-Bakterien, B) Entfernung von Gentamicin-Streifen, C ) Kombinierter Gentamicin/ Penicillin-G-Streifen (0,094 g/ml zentriert) auf der Oberseite der Streptococcus-Gruppe G-Bakterien, D) Penicillin-G-Streifen (0,094 g/ml zentriert), E) Entfernung von Penicillin G-Streifen, F) Kombiniertes Penicillin G / Gentamicin-Streifen (8 g/ml zentriert) auf streptococcus Gruppe G Bakterien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
2. Brühenprüfung
<ol><li>
gliederung
	<ol>
<li>Handschuhe und laborator</li>
		<li>Bereiten Sie den Arbeitsplatz bereit, indem Sie ihn mit 70% Ethanol sterilisieren</li>
		<li>Sammeln Sie 15mL MH Brühe mit 50% lysiertem Pferdeblut und 20 mg/ml n-NAD (MH-F)</li>
	</ol>
</li>
	<li>
(Optional) Führen Sie einen E-Test [Protokoll 1] durch, um das MIC auf Festkörpermedium zu bestimmen.
	<ol>
<li>Obwohl optional, ermöglicht ein solches Wissen eine bessere experimentelle Konstruktion (z. B. können die Konzentrationen von Antibiotika, die hinzugefügt werden, so konzipiert werden, dass sie den von der Platte ermittelten MIC-Wert umgeben), wodurch die Chancen für ein erfolgreiches Experiment verbessert werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung eines bakteriellen Inokulums. Wie bereits erwähnt, kann die Bakterielle Konzentration durch OD nm-Messungen oder McFarland-Trübungsstandards geschätzt werden.<ol>
<li>
OD600 nm Methode
		<ol>
<li>Erhalten Sie eine bakterielle Suspension mit einer etablierten bakteriellen Konzentration</li>
			<li>Verdünnen Sie die Kultur in MH-F Brühe, um eine OD600 von 0.003 zu erreichen</li>
		</ol>
</li>
		<li>
McFarland Trübungsmethode
		<ol>
<li>15 ml MH-F Brühe in ein steriles Rohr geben.</li>
			<li>Impfen Sie die MH-F-Brühe mit Bakterien (von einer Platte) auf eine McFarland-Ebene. Wirbel die Lösung kräftig. Gießen Sie die Lösung in eine sterile Petrischale.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zubereitung von Antibiotika
	<ol>
<li>Bestimmen Sie die gewünschte Antibiotikakonzentration<ol>
<li>Identifizieren Sie den MIC-Wert aus dem E-Test (z.B. 0,125 g/ml für Penicillin G und 8 g/ml für Gentamicin)</li>
			<li>Multiplizieren Sie den Agarplatten-MIC-Wert mit 24-27, was vier-sieben 2x seriellen Verdünnungen entspricht. Dies wird die Anfangskonzentration von Antibiotika sein. (z.B. für Penicillin G, sieben 2x serielle Verdünnungen: 0,125 g/ml x 27 = 16 g/ml; für Gentamicin vier 2x serielle Verdünnungen 8 g/mL x 24 = 128 g/ml</li>
			<li>Multiplizieren Sie den gewünschten Startwert 100x, um eine Lagerkonzentration der Antibiotika zu ermitteln (z. B. Bestände von 1,6 mg/ml Penicillin G und 12,8 mg/ml Gentamicin)</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bereiten Sie eine 100-fache Antibiotika-Lagerkonzentration entsprechend vor<ol>
<li>Lösen Sie die Antibiotika in 10ml autoklaviertem Wasser, und Wirbel, um eine Stammlösung zu erzeugen (z. B. 16 mg Penicillin G und 128 mg Gentamicin, um die oben genannten Bestände zu schaffen)</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hinzufügen von Bakterien zu Mikroplattenbrunnen
	<ol>
<li>Aliquot 200 'l MH-F Brühe mit Bakterien inoculum zu den Brunnen in den ersten 3 Reihen einer 96-Well-Mikrotiterplatte für ein Experiment in Triplicate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hinzufügen von Antibiotika zu Mikroplattenbrunnen
	<ol>
<li>Fügen Sie der ersten Bohrsäule (A1, B1, C1) 200 L zusätzliche MH-F-Brühe mit Bakterien hinzu, um das Gesamtvolumen auf 400 l zu erhöhen.</li>
		<li>Fügen Sie der ersten Bohrsäule 4 L der Antibiotikakonzentration hinzu. Da die Probe 400 l enthält, führt dies zu einer 100-fachen Verdünnung der Antibiotika.</li>
		<li>Generieren Sie eine 2x serielle Verdünnung, indem Sie 200 L Bakterien/Antibiotika von A1 auf A2 bis hin zu A11 übertragen. Pipetten Sie kräftig zwischen den Verdünnungen. Wiederholen Sie den Schritt für zusätzliche Zeilen.</li>
		<li>Entfernen Sie 200 l aus der Spalte 11, so dass das Endvolumen in allen Brunnen 200 l beträgt.</li>
		<li>Lassen Sie die letzte Spalte (A12, B12, C12) ohne Antibiotika als Kontrollen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bestimmen von MIC-Werten
	<ol>
<li>Die 96-Well-Mikrotiterplatte 24 Stunden lang bei 37°C ohne Schütteln inkubieren.</li>
		<li>Der MIC-Wert ist definiert als der letzte Brunnen in der Verdünnungsreihe, der kein sichtbares Wachstum von Bakterien aufweist (Abbildung 4). Diesem Wert kann jedoch nur vertraut werden, wenn die ursprüngliche Inokulumgröße korrekt war.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig4.jpg"> Abbildung 4: MIC-Bestimmung durch Brüheverdünnung. MIC ist hier definiert als der letzte Brunnen, der Klarheit aufweist (kein Wachstum von Bakterien), bevor er Trübung ändert. Row sind Duplikate des MIC-Werts von Penicillin G und Zeile sind Duplikate des MIC-Werts von Gentamicin, sowohl im Vergleich zu einem Isolat der Streptococcus-Gruppe G. A) tatsächlichen experimentellen Ergebnisse, B) schematische Interpretation der Werte aus A ( grau = kein Wachstum; weiß = Wachstum). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig5.jpg"> Abbildung 5: Schematisches Verfahren der Verdünnungsreihen zur Zählung der ursprünglichen Bakterienkonzentration. Die Verdünnungen wurden wie beschrieben durchgeführt (20 l in 180 l für eine 10-fache Verdünnungsserie verdünnt), und dann werden 10 l aus den Reihen A-H auf zwei getrennten Blutagarplatten plattiert, wie angegeben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<ol start="8"><li>
Bestimmen der ursprünglichen Inokulumgröße HINWEIS: Mikrobroth-Assays sind hochempfindlich für die verwendete ursprüngliche Inokulumgröße. Eine übermäßige Inokulumgröße wird ein falsch positives Ergebnis geben, da die hinzugefügten Antibiotika das Wachstum in diesem Verhältnis nicht mehr hemmen können. Daher ist es wichtig zu überprüfen, wie viel Bakterien zu den Mikrobrunnen hinzugefügt wurden. Während die Daten zum Zeitpunkt des Experiments nicht verfügbar sein werden (aufgrund der Notwendigkeit einer 24-stunden-Inkubation), dienen sie als Kontrolle. Liegt die Anzahl der zugesetzten Bakterien innerhalb des angegebenen Konzentrationsbereichs, können die MIC-Werte vertrauenswürdig sein. Wenn das Inokulum zu hoch oder zu niedrig war, muss das Experiment wiederholt werden.<ol>
<li>
Die Bakterien seriell verdünnen
		<ol>
<li>Bereiten Sie eine 96-Well-Mikrotiterplatte vor, um die ursprüngliche bakterielle Konzentration zu verdünnen, um die Inokulumgröße zu bestimmen. Das Optimum ist ein Volumen von 200 l mit 105-6 Bakterien. Um die Verdünnungen durchzuführen, zuerst aliquot 180 l sterile PBS zu jedem Brunnen in B-H (in Dreifach1-3).</li>
			<li>Als nächstes fügen Sie A 100 l bakterielle Lösung hinzu (in dreifacher 1-3).</li>
			<li>Generieren Sie eine 10-fache serielle Verdünnung (in Dreifacharbeit), indem Sie 20-l-Bakterien von A nach B übertragen, pipet kräftig. Wiederholen Sie die Schritte für C-H.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Platte die bakteriellen Verdünnungen für inokulum Größenbestimmung
		<ol>
<li>Markieren Sie Blut-Agar-Platten nach Abbildung 5.</li>
			<li>10 l von der seriellen Verdünnung auf die Platte nach Abbildung 5übertragen.</li>
			<li>Inkubieren Sie die Platte bei 37°C für 20-24 Stunden.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Bestimmen Sie die bakterielle Inokulumgröße
		<ol>
<li>Zählen Sie die Bakterienzahl in Flecken innerhalb von 5-50 Kolonien (Abbildung 6).</li>
			<li>Berechnen Sie die anfängliche Inokulumgröße, indem Sie den Mittelwert der Dreifachproben berechnen, multiplizieren Sie mit dem Verdünnungsfaktor (z. B. 10x für B-Proben, 100x für C-Proben, 1000x für D-Proben usw.) und dann mit 100, um das Aufspürvolumen von 10 Inokulumgröße in cfu/mL. Wenn sich das Inokulum innerhalb von 105-6 cfu/mL befindet, können die MIC-Daten vertrauenswürdig sein.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig6.jpg"> Abbildung 6: Bestimmung der Inokulumgröße. Bakterien, die gemäß Abbildung 5 geimpft wurden, wurden 20-24 Stunden bei 37°C inkubiert und dann gezählt. Reihe D hat eine gute Anzahl von Kolonien zu zählen (z.B. 5-50). Die Proben in A sind unverdünnt, B wird 10x verdünnt, C wird 100x verdünnt und D wird 1000x verdünnt, und an jedem Punkt werden nur 10 l plattiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Antibiotikaresistenz ist ein weltweites Gesundheitsproblem. Um Resistenzmechanismen von Mikroben zu bestimmen, sind Methoden, die auf Synergie und Antagonismus mit verschiedenen Antibiotika testen, von entscheidender Bedeutung. Die E-Test-Methode ist schnell, einfach zu replizieren, und kann verwendet werden, um jedes synergistische Potenzial von Kombinationstherapien zu untersuchen. Die Brühe-Verdünnungsmethode kann auch bewertet werden, um die bakterizide Aktivität vorherzusagen. Um die Resistenzmechanismen verschieden...

antibiotika-empfindlichkeitstests: epsilometertests zur bestimmung der mhk-werte von zwei antibiotika und zur bewertung der antibiotika-synergie

Quelle: Anna Bläckberg1, Rolf Lood1 1 Institut für Klinische Wissenschaften Lund, Abteilung für Infektionsmedizin, Biomedical Center, Universität Lund, 221 00 Lund Schweden
Die Kenntnis der Wechselwirkungen zwischen Antibiotika und Bakterien ist wichtig, um zu verstehen, wie Mikroben Antibiotikaresistenzen entwickeln. 1928 entdeckte Alexander Fleming Penicillin, ein Antibiotikum, das seine antibakterielle Funktion ausübt, indem es die Zellwandregeneration stört (1). In der Folge wurden weitere Antibiotika mit unterschiedlichen Wirkmechanismen entdeckt, darunter Medikamente, die die DNA-Replikation und die Proteintranslation in Bakterien hemmen; in den letzten Jahren wurden jedoch keine neuen Antibiotika entwickelt. Die Resistenz gegen aktuelle Antibiotika hat zugenommen, was zu schweren Infektionskrankheiten führt, die nicht wirksam behandelt werden können (2). Hier beschreiben wir verschiedene Methoden zur Beurteilung der Antibiotikaresistenz in Bakterienpopulationen. Jede dieser Methoden funktioniert, unabhängig vom Wirkmechanismus der verwendeten Antibiotika, weil der bakterielle Tod das gemessene Ergebnis ist. Antibiotikaresistenzen werden nicht nur schnell spezifisch durch Krankenhäuser verbreitet, sondern auch in der gesamten Gesellschaft. Um solche Resistenzmittel zu untersuchen, wurden verschiedene Methoden entwickelt, darunter der Epsilometer-Test (E-Test) und der Brühverdünnungstest (3).
Der E-Test ist eine etablierte Methode und ein kostengünstiges Werkzeug, das Minimale hemmende Konzentration (MIC) Daten quantifiziert, die niedrigste Konzentration eines antimikrobiellen, das das sichtbare Wachstum eines Mikroorganismus hemmt. Je nach verwendetem Bakterienstamm und Antibiotika kann der MIC-Wert zwischen unter g/ml und &gt;1000 g/ml (4) variieren. Der E-Test wird mit einem Kunststoffstreifen mit einem vordefinierten Antibiotikagradienten durchgeführt, der mit der MIC-Messskala in g/ml bedruckt ist. Dieser Streifen wird direkt auf die Agarmatrix übertragen, wenn er auf die geimpfte Agarplatte aufgetragen wird. Nach der Inkubation ist entlang des Streifens eine symmetrische elliptische Hemmungszone sichtbar, da das Bakterienwachstum verhindert wird. MIC wird durch den Hemmbereich definiert, der endpunkt ist, an dem die Ellipse den Streifen schneidet. Eine weitere gängige Methode zur Bestimmung von MIC ist die Mikrobrühe-Verdünnungsmethode. Mikrobrühe Verdünnung enthält verschiedene Konzentrationen des antimikrobiellen Mittels zu einem Brühe Medium mit geimpften Bakterien hinzugefügt. Nach der Inkubation ist MIC definiert als die niedrigste Konzentration von Antibiotika, die sichtbares Wachstum verhindert (5). Es ist auch eine quantitative Methode und kann auf mehrere Bakterien angewendet werden. Zu den Nachteilen dieser Methode gehören die Möglichkeit von Fehlern bei der Herstellung der Konzentrationen der Reagenzien und die große Anzahl von Reagenzien, die für das Experiment erforderlich sind. Die Messung der Antibiotikaresistenz ist sowohl aus klinischer als auch aus Forschungssicht unerlässlich, und diese In-vitro-Methoden zur Untersuchung von Resistenzen werden im Folgenden diskutiert und vorgestellt.
Das Resistenzprofil für ein bestimmtes Bakterium kann angewendet werden, um die Antibiotikabehandlung zu optimieren, um festzustellen, ob ein Patient von einer Kombinationsbehandlung im Vergleich zur Einzeltherapie profitieren würde. Für die Verwendung von mehr als einem Antibiotikum zu einem zeitpunkt, ist es zwingend notwendig, ihre Wechselwirkungen miteinander zu kennen und, wenn sie eine additive, synergistische oder antagonistische Wirkung haben. Eine additive Wirkung kann gesehen werden, wenn die gemeinsame Wirkung der Antibiotika der Wirksamkeit der einzelnen Antibiotika in einer gleichen Dosis gegeben entspricht. Synergien zwischen Antibiotika hingegen sind vorhanden, wenn die gemeinsame Wirkung der Antibiotika stärker ist, als wenn das Medikament allein verabreicht würde (6). Die Anwendung von Kombinationen antimikrobieller Behandlungwird in Kombinationen wird verwendet, um das Auftreten von antimikrobiellen Resistenzen zu vermeiden, um die Wirkung der individuellen Antibiotikabehandlung zu verstärken (7). Die Kenntnis des Antagonismus ist ebenso wichtig, um eine unnötige Verwendung von antimikrobiellen Kombinationen zu verhindern. Die E-Test-Methodik bietet einfache und mehrere Möglichkeiten, mögliche Synergien und Antagonism zwischen verschiedenen antimikrobiellen Wirkstoffen zu bestimmen. Um der Verbreitung antibiotikaresistenter Krankheitserreger zu begegnen, ist die Kenntnis möglicher synergistischer und antagonistischer Mechanismen bestimmter Antibiotika wichtig, was zu klinischer Wirksamkeit und dem Kampf gegen die Multipharmaresistenz führt.
Die Bestimmung von Synergien mittels E-Tests kann in zwei allgemeine Ansätze unterteilt werden: Kreuz- und Nicht-Kreuztests. Während beide Synergietests auf den Vorkenntnissen einzelner MIC-Werte beruhen, unterscheiden sich beide Ansätze in Methodik und konzeptionellem Ansatz leicht. In einem nicht-kreuz-Synergie-Test wird das erste Antibiotikum in dem zu testenden Paar auf eine MitBakterien geimpfte Agarplatte gelegt. Nachdem die Antibiotika aus dem ersten Streifen die Platte eininfundierten (z. B. nach 1 Stunde), wird der Streifen entfernt und ein neuer Streifen mit dem zweiten Antibiotikum wird genau an der gleichen Stelle wie das erste platziert, wobei sichergestellt ist, dass die beiden einzelnen MIC-Werte auf jedem ot sie. Die resultierende Hemmzone kann dann wie oben beschrieben analysiert und Synergien auf der Grundlage der Gleichung 1 berechnet werden.
Gleichung 1 - Fraktionelle hemmende Konzentrationen (FIC)
<img src="/files/ftp_upload/10512/10512eq1.jpg">
Werte &gt;0,5 zeigt Synergien.
Während der Prüfer mit einfach zu analysierenden Platten belohnt wird, ist die Methode aufgrund des Streifenwechsels sowie der Notwendigkeit, zwei Platten pro Experiment zu verwenden, etwas mühsam und zeitaufwändig. Stattdessen wird oft ein Kreuztest eingesetzt. Anstatt die beiden verschiedenen E-Teststreifen anschließend übereinander (nach Entfernung des ersten) hinzuzufügen, werden beide gleichzeitig, jedoch in Form eines Kreuzes (90°<img align="center" src="/files/ftp_upload/10512/10512eq3.jpg">Winkel) platziert, wobei die beiden zuvor ermittelten MIC-Werte den 90°-Winkel bilden. Durch diesen Ansatz wird nur eine Platte pro Synergietest benötigt, sowie weniger Arbeit, so dass es eine bevorzugte Wahl ist, obwohl es etwas schwieriger zu analysieren ist. Die neuen MIC-Werte im kombinierten Antibiotika-Ansatz können als modifizierte Hemmzonen visualisiert werden, nach denen Synergien durch Gleichung 1 bestimmt werden können.
Anstatt einen Agar-Platten-Ansatz zu verwenden, kann ein Mikrobrühe-Ansatz aufgrund seiner höheren Flexibilität oft bevorzugt sein (z. B. die Fähigkeit, bestimmte Konzentrationen von Antibiotika außerhalb der Grenzen eines E-Teststreifens zu wählen). Darüber hinaus werden Mikrobrühe-Tests vorgeschlagen, empfindlicher zu sein, da antibiotika bereits in einer flüssigen Lösung verteilt werden, nicht abhängig von der Dissoziation innerhalb einer festen Phase (Agarplatte). Brunnen in einer 96-Well-Mikroplatte werden mit einer festgelegten Anzahl von Bakterien geimpft (106 cfu/ml: die Bakterienkonzentration kann durch OD600 nm-Messungen, Trübungsnormen oder durch Diespread-Beschichtung von Proben aus 10-fachen bakteriellen seriellen Verdünnungen geschätzt werden), und Antibiotika in verschiedenen Verdünnungen werden den Brunnen zugesetzt. In ähnlicher Weise wird MIC als Schnittpunkt (gut/punkt) mit der niedrigsten Konzentration von Antibiotika bestimmt, die das sichtbare Wachstum von Bakterien hemmt.
Experimentelles Ziel
<ul><li>Das folgende Projekt beschreibt Strategien zur Bestimmung der MIC-Werte von Penicillin G und Gentamicin der Streptococcus-Gruppe G durch zwei verschiedene Methoden, E-Test und Mikrobrühe-Verdünnung. Für den E-Test wurden Mueller-Hinton-Agarplatten, die mit Streptococcus-Gruppe G geimpft wurden, in Kombination mit Gradientenstreifen von Penicillin G und/oder Gentamicin verwendet; während MH-Brühe mit 50% lysiertem Pferdeblut und 20 mg/ml -NAD zusammen mit Streptococcus-Gruppe G in einem Mikrobrühe-Ansatz mit löslichen Antibiotika verwendet wurden.</li>
</ul>Materialien
<ul><li>Bakterielle Kolonien auf einer Blutagarplatte, gelagert &lt;7 Tage in 4°C</li>
	<li>Blut-Agar-Platten</li>
	<li>0.5 McFarland Standard<ul>
<li>1% BaCl2
</li>
		<li>1% H2SO4
</li>
	</ul>
</li>
	<li>Salinerohr (2 ml)</li>
	<li>Baumwolle gekippt Applikator</li>
	<li>Mueller-Hinton AgarPlatten (MHA-Platten)</li>
	<li>MH-Brühe mit 50% lysiertem Pferdeblut und 20 mg/ml -NAD (MH-F)</li>
	<li>E-Test Penicillin/Gentamicin (oder Antibiotika von Interesse) (BioMerieux, Marcy l'Etoile, Frankreich, Schweden)</li>
	<li>Antibiotika Penicillin/Gentamicin (oder Antibiotika von Interesse (Pulver/Lösung))</li>
</ul>Hinweis: Die spezifischen Medien, die für das Bakterienwachstum verwendet werden, können für verschiedene Arten variieren.

MIC-Werte im E-Test In Abbildung 1 wurden einzelne MIC-Werte als 0,094 g/ml für Penicillin G und 8 g/ml für Gentamicin identifiziert. Bei Synergietests zeigten beide einen MIC-Wert für Penicillin G von 0,064 g/ml(Abbildungen 2, 3), während Gentamicin für Kreuz- und Nicht-Kreuztests einen MIC 4 g/ml hatte. Beachten Sie, dass aufgrund der unterschiedlichen Inkubationszeiten der Streifen in den beiden Einstellungen eine leichte Diskrepanz zwische...

Antibiotika-Empfindlichkeitstests: Epsilometertests zur Bestimmung der MHK-Werte von zwei Antibiotika und zur Bewertung der Antibiotika-Synergie

Source: Anna Bl&#228;ckberg1, Rolf Lood1
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 ...

Die Antibiotika-Empfindlichkeit ist definiert als die Empfindlichkeit eines Bakteriums gegenüber Antibiotika und kann mit einem Brühenverdünnungstest oder einem Epsilometer-Test, auch E-Test genannt, gemessen werden. Bei der Bouillonverdünnungsmethode wird eine standardisierte Anzahl von Bakterien zu einem Wachstumsmedium hinzugefügt, das serielle Antibiotikaverdünnungen enthält. Wenn sie anfällig sind, können die Bakterien bei höheren Antibiotikakonzentrationen nicht wachsen, sondern vermehren sich bei niedrigeren Antibiotikakonzentrationen weiter, wodurch die Medien trüb werden. Die niedrigste Antibiotikakonzentration, bei der die Bakterien nicht mehr überleben oder sich vermehren können, wird als minimaler Hemmkonzentrationswert (MIC) des Antibiotikums für die jeweiligen Bakterien bezeichnet. Bei einem E-Test wird ein mit einem vordefinierten Gradienten von Antibiotikum imprägnierter Kunststoffstreifen auf einen frisch ausgestreuten Bakterienrasen auf eine Mueller-Hinton-Agar oder MH-A, Petriplatte, aufgetragen. Das Antibiotikum diffundiert in das Agarmedium, wo es von den Bakterien aufgenommen wird. Wenn sie anfällig sind, können sich die Bakterien nicht vermehren und sterben ab, wodurch eine klare Zone um den E-Streifen gebildet wird, die als Wachstumshemmungszone bezeichnet wird. An der Stelle, an der sich das Wachstum mit dem E-Streifen schneidet, gibt der entsprechende Wert auf der Waage den MHK-Wert des Antibiotikums an. Oft werden Antibiotika in Kombination eingesetzt, um das Auftreten von antibiotikaresistenten Bakterienstämmen zu verhindern. Daraus ergibt sich oft eher ein synergistischer als ein additiver Effekt. Synergistisch bedeutet, dass die kombinierte Wirkung der beiden Antibiotika größer ist als die Summe ihrer einzelnen Wirkungen. Als signifikant gilt der Effekt jedoch erst, wenn der MHK-Wert der Antibiotikakombination um mindestens das Zweifache abnimmt. Dieses Kriterium wird durch die Berechnung des fraktionierten inhibitorischen Konzentrationsindex (FIC) bewertet. Durch Summieren des Verhältnisses der MHK jedes Antibiotikums in Kombination mit der MHK jedes einzelnen Antibiotikums ergibt sich ein FIC-Index von weniger als 0,5 für eine Synergie. Die Antibiotika-Synergie kann mit zwei E-Test-basierten Methoden gemessen werden: einem Non-Cross-Test oder einem Cross-Test. In einem Non-Cross-Test werden zunächst die E-Streifen für zwei verschiedene Antibiotika mit vorgegebenen MHK-Werten auf zwei separate Platten aufgebracht. Nachdem die Antibiotika in das Medium diffundiert sind, werden die ursprünglichen E-Streifen entfernt und die E-Streifen für die alternativen Antibiotika so platziert, dass ihre MHK-Skalen genau über den MHK-Schuppen der vorherigen Streifen liegen. In einem Kreuztest, der eine schnellere Version des Nicht-Kreuztests darstellt, werden die E-Streifen der beiden Antibiotika in einer Kreuzformation zusammengelegt, so dass die Schuppen ihrer MIC-Markierungen an der Schnittmenge einen 90-Grad-Winkel bilden. Nach der Inkubation in beiden Techniken wird der MHK-Wert jedes Antibiotikums in Kombination mit dem anderen Antibiotikum an der Stelle abgelesen, an der sich die Wachstumshemmungszone mit dem Rand des E-Streifens schneidet. Anschließend wird der FIC-Index berechnet. In diesem Video wird gezeigt, wie der MHK-Wert eines bestimmten Antibiotikums für ein bestimmtes Bakterium mit Hilfe eines E-Tests und eines Mikrobrühe-Verdünnungstests bestimmt werden kann. Sie lernen auch, wie Sie die Synergie zwischen zwei Antibiotika mit einem Kreuztest und einem Nicht-Kreuztest bestimmen können. Ziehen Sie zunächst eine geeignete persönliche Schutzausrüstung an, einschließlich Laborhandschuhen und einem Laborkittel. Als nächstes sterilisieren Sie den Arbeitsbereich mit 70 % Ethanol. Als nächstes sammeln Sie 15 Milliliter sterile Mueller-Hinton-Brühe mit 50 % lysiertem Pferdeblut und 20 Milligramm Beta-Nicotinamid pro Milliliter. Und fünf bis acht Mueller-Hinton-Agarplatten. Um nun einen McFarland-Trübungsstandard Nummer 0,5 herzustellen, messen Sie 9,95 Milliliter 1%ige Schwefelsäurelösung ab. Geben Sie dann 50 Mikroliter 1%ige Bariumchloridlösung in die Schwefelsäurelösung. Die Lösung gut vortexen, um eine trübe Suspension zu erhalten. Decke die Tube mit Alufolie ab und lege sie beiseite. Geben Sie anschließend einen Milliliter Kochsalzlösung in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Verwenden Sie eine sterile Schlaufe, um eine Probe des Bakterienwachstums von Ihrer Bakterientestplatte zu kratzen, hier Streptokokken Gruppe G. Legen Sie dann die bakterienbeladene Schlaufe in die Kochsalzlösung, rühren Sie vorsichtig um und wirbeln Sie das Röhrchen dann gut ein. Legen Sie nun die Bakteriensuspension und die McFarland-Trübungsstandards nebeneinander und vergleichen Sie sie auf Trübungsäquivalenz. Fügen Sie entweder zusätzliche Kochsalzlösung oder Bakterienkolonien hinzu, bis die Trübung der Bakteriensuspension der des Standards entspricht. Sobald die gewünschte Trübung erreicht ist, tauchen Sie einen sterilen Wattestäbchenapplikator in die Bakteriensuspension. Um die MH-A-Platte zu impfen, tupfen Sie die gesamte Oberfläche der Platte vorsichtig mit einer Zickzackbewegung ab. Beschriften Sie als Nächstes die Unterseiten der Platten mit dem Namen der Bakterien und dem Datum. Nehmen Sie zu Beginn einen Penicillin G E-Teststreifen heraus und halten Sie ihn mit einer Pinzette am Rand fest. Legen Sie den Streifen vorsichtig in die Mitte der frisch getupften MH-A-Platte und setzen Sie den Deckel wieder auf. In diesem Beispiel wird auch ein zweites Antibiotikum, Gentamicin, getestet. So wird der Streifenplatzierungsprozess mit der zweiten Platte und einem Gentamicin E-Teststreifen wiederholt. Um die Ergebnisse des E-Tests zu ermitteln, entnehmen Sie die erste Platte, die den Penicillin G E-Teststreifen enthält. Bestimmen Sie nun den Punkt, an dem sich die Hemmzone mit dem Antibiotikastreifen schneidet. Lesen Sie den entsprechenden Zahlenwert auf der Skala ab. Dieser Wert stellt den MHK-Wert von Penicillin G dar. Bestimmen Sie den MHK-Wert für Gentamicin auf die gleiche Weise. Beimpfen Sie zunächst eine MH-A-Platte mit Bakterien des Streptokokken-Stammes G. Beschriften Sie den Boden des Tellers mit dem Namen der Bakterien, den zu verwendenden Antibiotika und dem Datum. Legen Sie nun einen E-Teststreifen für das gewünschte Antibiotikum in die Mitte der Platte. Halten Sie dann den zweiten Teststreifen in einem 90-Grad-Winkel zum ersten Streifen und suchen Sie die MIC-Markierung. Legen Sie den zweiten E-Streifen vorsichtig über den ersten an der Stelle, an der sich die beiden MIC-Werte schneiden. Sobald die Streifen platziert sind, bewegen Sie sie nicht. Inkubieren Sie die Platten anschließend 18 bis 20 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inokulation von zwei MH-A-Platten mit Bakterien des Streptokokken-Stammes G legen Sie einen E-Teststreifen für ein Antibiotikum auf die Oberfläche einer Platte. Legen Sie dann einen E-Teststreifen für das andere Antibiotikum wie gezeigt auf die zweite Platte. Markieren Sie mit einer Impfschlaufe aus Kunststoff den MHK-Wert jedes Antibiotikums auf der Oberfläche der jeweiligen Platte. Decken Sie dann die Platten ab und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie danach mit einer Pinzette die E-Streifen. Sammeln Sie als Nächstes eine der Platten und einen E-Teststreifen für das andere Antibiotikum. Halten Sie den E-Teststreifen über den Abdruck des ersten Streifens und suchen Sie den Punkt, an dem der MIC-Wert auf dem E-Streifen mit der markierten Linie übereinstimmt. Legen Sie den Streifen vorsichtig an diesen Schnittpunkt. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die zweite Platte und inkubieren Sie beide Platten bei 37 Grad Celsius für 18 bis 20 Stunden. Zuerst wird eine Bakteriensuspension mit einer festgelegten Bakterienkonzentration erhalten und die Kultur in MHF-Bouillon verdünnt, um einen OD600 von 0,003 zu erreichen. Wiegen Sie anschließend 16 Milligramm Penicillin G und 128 Milligramm Gentamicin ab. Jedes gewogene trockene Antibiotikum wird in konische 215-Milliliter-Röhrchen überführt. Geben Sie 10 Milliliter destilliertes Wasser in jedes der konischen Röhrchen und mischen Sie es gut durch Vortexen. Beschriften Sie die Röhrchen mit dem Namen und der Konzentration des Antibiotikums. Wenn Sie den Assay in dreifacher Ausfertigung durchführen, geben Sie 400 Mikroliter der Arbeitsbakterienlösung in die ersten Vertiefungen von drei Reihen einer 96-Well-Mikrotiterplatte. Geben Sie anschließend 200 Mikroliter der funktionierenden Bakterienlösung in MHF-Brühe in die Vertiefungen der drei Reihen. Um nun eine zweifache serielle Antibiotikaverdünnung zu erzeugen, geben Sie zunächst vier Mikroliter Antibiotika-Bestand in die erste Vertiefung, wodurch eine 100-fache Verdünnung erzeugt wird. Übertragen Sie nacheinander 200 Mikroliter Bakterien-Antibiotika-Lösung in jede Vertiefung, beginnend mit der ersten Vertiefung bis zur zweiten bis letzten Vertiefung in jeder Reihe, und stellen Sie sicher, dass die richtige Mischung gewährleistet ist, indem Sie nach jedem Transfer zwei- bis dreimal pipettieren. Entsorgen Sie die letzten 200 Mikroliter der Bakterien-Antibiotika-Lösung. Um die Ergebnisse des Brühe-Mikroverdünnungstests für Penicillin G zu bestimmen, lokalisieren Sie zunächst die Vertiefungen, die kein sichtbares Bakterienwachstum aufweisen, was durch einen Mangel an Trübung angezeigt wird. Identifizieren Sie aus diesen Vertiefungen die Vertiefung mit der niedrigsten Antibiotikakonzentration. Dieser stellt den MHK-Wert von Penicillin G für die getesteten Bakterien dar. Der MHK-Wert von Gentamicin kann mit dem gleichen Assay und der gleichen Technik bestimmt werden. Um die Ergebnisse des Non-Cross-Tests zu bestimmen, entnehmen Sie die erste Platte, die einen Penicillin-G-E-Streifen enthält. Bestimmen Sie dann den Punkt, an dem sich die Wachstumshemmungszone mit dem Antibiotikastreifen schneidet. Der entsprechende Wert auf der Skala stellt den MHK-Wert für Penicillin G in Kombination mit Gentamicin dar. In diesem Beispiel beträgt der MHK-Wert in Kombination 0,064 Mikrogramm pro Milliliter. Sammeln Sie nun die zweite Platte, die den Gentamicin E-Streifen enthält, und bestimmen Sie den MHK-Wert in Kombination, wie zuvor gezeigt. Um die Wirkung der Kombination zu bewerten, berechnen Sie zunächst die fraktionierte Hemmkonzentration oder FIC für Penicillin G, indem Sie die MHK in Kombination durch die MHK des Antibiotikums allein dividieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang für Gentamicin. Berechnen Sie dann den FIC-Index mit der hier gezeigten Gleichung. Eine zweifache Reduktion des MIC-Wertes in Kombination ergibt einen FIC-Indexwert von mindestens 0,5 und zeigt eine Synergie zwischen Penicillin G und Gentamicin. In diesem Fall beträgt der berechnete FIC-Wert 1,18, was größer als 0,5 ist. Die Ergebnisse zeigen daher keine Synergie zwischen Penicillin G und Gentamicin gegen den Streptokokken-Stamm der Gruppe G. Um die Ergebnisse des Kreuztests zu ermitteln, bestimmen Sie zunächst den Punkt, an dem sich die Wachstumshemmungszonen mit ihren jeweiligen E-Streifen schneiden. Lesen Sie den numerischen Wert auf jedem E-Teststreifen ab, der diesem Schnittpunkt entspricht. Diese Werte stellen den MHK-Wert in Kombination für Penicillin G und Gentamicin dar. Um den Effekt der Kombination auszuwerten, berechnen Sie als Nächstes den FIC-Index mit der hier gezeigten Gleichung. In diesem Beispiel beträgt der berechnete FIC-Wert 1,18, was größer als 0,5 ist. Das bedeutet, dass Penicillin G und Gentamicin nicht synergistisch gegen den Streptokokken-Stamm der Gruppe G wirken.

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measuring bacterial resistance with e-tests

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform.

The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with bacteria, and the MIC scale is printed directly on the strip in micrograms per milliliter. After incubation, an ellipse-shaped zone appears where growth is blocked. The MIC is read where that inhibition zone meets the strip.

A similar MIC method is microbroth dilution. In this approach, bacteria are placed in broth with different antibiotic concentrations. After incubation, the MIC is the lowest concentration that still stops visible growth. This method is quantitative and can be used with several bacteria, although it can require many reagents and careful preparation of the concentrations.

Knowing a bacterium’s resistance profile can help guide treatment choices. It can show whether a patient may benefit from one antibiotic or from a combination. When two antibiotics are used together, they may act in an additive, synergistic, or antagonistic way. Additive means the combined effect matches the effect of each drug at equal dose, while synergy means the combined effect is stronger than either drug alone.

E-tests can also be used to look for synergy and antagonism between antimicrobial agents. One method is non-cross testing. In this setup, one antibiotic strip is first placed on the agar plate, allowed to diffuse, and then removed. A second strip is placed in the same position, with the two MIC values aligned, and the result is used to calculate the fractional inhibitory concentration, or FIC. Values above 0.5 show synergy. This method is simple to read, but it takes more time and uses two plates.

A faster option is the cross test. Here, both E-test strips are placed at the same time in a 90-degree cross, with the known MIC values meeting at the angle. Only one plate is needed, so the method saves work, although the result can be a little harder to analyze. The changed inhibition zones are then used to determine whether the antibiotics act synergistically.

A broth-based approach can also be used for combination testing. It gives more flexibility because specific antibiotic concentrations can be chosen outside the limits of an E-test strip. It may also be more sensitive because the antibiotics are evenly distributed in liquid, rather than relying on diffusion through agar. In this method, wells in a 96-well plate are filled with a set number of bacteria and different antibiotic dilutions, and the MIC is the lowest concentration that prevents visible growth.

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

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creating a winogradsky column: a method to enrich the microbial species in a sediment sample

creating-winogradsky-column-method-to-enrich-microbial-species

Winogradsky Column Microbial Layers and Gradients

A Winogradsky column shows how microbial layers form in mud and water over time. It is a clear, enclosed ecosystem that helps scientists grow sediment microbes that are hard to culture in a test tube or on a petri dish. By keeping conditions close to a microbe’s natural habitat, the column makes it possible to study organisms that help drive Earth’s biogeochemical cycles. The column is built from pond or wetland sediment mixed with water in a transparent container. Extra sources of carbon,...

serial dilutions and plating: microbial enumeration

serial-dilutions-and-plating-microbial-enumeration

Counting Bacteria with Dilution Plates

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs. Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed...

enrichment cultures: culturing aerobic and anaerobic microbes on selective and differential medias

enrichment-cultures-culturing-aerobic-anaerobic-microbes-on-selective

Selective Media for Bacterial Isolation

Selective media help scientists isolate bacteria by supporting some microbes and blocking others. This lab also uses differential media, which reveal a visible chemical trait in the organism being grown. Together, these methods help identify bacteria from mixed samples. Prokaryotic cells live in almost every environment on Earth. They also show wide metabolic diversity, so the growth medium must supply the molecules they need for energy. Some microbes are extremophiles, meaning they live in...

pure cultures and streak plating: isolation of single bacterial colonies from a mixed sample

pure-cultures-streak-plating-isolation-single-bacterial-colonies-from

Streak Plate Method for Isolating Bacteria

The streak plate method is used to isolate single bacterial colonies from a mixed sample. It helps separate one bacterial type from another so a pure culture can be grown. This is important in both clinical and research settings, where bacteria often grow together in mixed cultures. Pure cultures are needed for later genetic and protein studies. They are also used to check whether a sample is pure and to identify infectious agents from clinical samples. Because different strains can affect...

16s rrna sequencing: a pcr-based technique to identify bacterial species

16s-rrna-sequencing-pcr-based-technique-to-identify-bacterial

Bacterial ID with 16S rRNA Gene Sequencing

Bacterial identification with 16S rRNA gene sequencing helps scientists tell bacterial species apart. It is used in microbial ecology to study biodiversity in environmental samples and in medical microbiology to help diagnose infected patients. Traditional methods include microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays. Molecular methods have changed how bacteria are identified. 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing is often faster...

growth curves: generating growth curves using colony forming units and optical density measurements

growth-curves-generating-growth-curves-using-colony-forming-units

Bacterial Growth Stages and Cell Counts

Bacterial growth stages and cell counts show how a culture changes over time. This page follows a batch culture as it moves through lag, exponential, stationary, and death phases. It also shows how colony forming units, or CFU, and optical density can be used to measure that growth. Lag phase is the time bacteria need to adjust to a new environment before fast division begins. During exponential phase, cells grow and divide at the fastest rate, and DNA replication, RNA transcription, and...

antibiotic susceptibility testing: epsilometer tests to determine mic values of two antibiotics and evaluate antibiotic synergy

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform. The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with...

microscopy and staining: gram, capsule, and endospore staining

microscopy-and-staining-gram-capsule-and-endospore-staining

Bacterial Stains for Cell Walls and Spores

Bacterial stains help scientists see cell walls, capsules, and endospores with a compound light microscope. Many bacteria are hard to tell apart with light alone because they are small, colorless, and can look similar under the lens. Staining makes these hidden features visible and helps identify different bacteria. A compound microscope uses more than one lens to magnify a sample. Its objective lens collects light near the specimen, and the eyepiece enlarges the image. Many compound...

plaque assay: a method to determine viral titer as plaque forming units (pfu)

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Phage Plaque Test for Counting Viruses

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect prokaryotic cells. The plaque assay is a classic way to count these viruses by measuring viral titer, which is the amount of virus in a sample. It was first described in 1952 and is still one of the most reliable methods for determining viral titer. Phages were identified in the early 20th century by Twort and d'Hérelle. They have since been recognized for their therapeutic value and for their role in human and global ecosystems. Interest in...

transformation of e. coli cells using an adapted calcium chloride procedure

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Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency. Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation.

conjugation: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

conjugation-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from-donor-to

Bacterial Gene Transfer by Conjugation in E. coli

Bacterial conjugation is a form of horizontal gene transfer in E. coli that moves DNA from one cell to another through direct contact. It was first discovered by Lederberg and Tatum in 1946. Unlike transformation or transduction, conjugation is a natural, one-way transfer of DNA from a donor cell to a recipient cell. This process can increase bacterial genetic diversity. It is often described as a type of bacterial mating. It has also helped drive the spread of antibiotic-resistant bacteria.

phage transduction: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

phage-transduction-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from

Using P1 Phage to Move Antibiotic Resistance in E. coli

Bacteriophage transduction moves DNA between bacteria by using a phage, or bacterial virus, as the carrier. In this process, a phage can deliver genetic material from one bacterium to another. The method is a form of horizontal gene transfer and is important in both bacterial evolution and laboratory genetics. Phages were first described in the early 1900s, and transduction was named in 1951 by Norton Zinder and Joshua Lederberg. The transcript describes two main phage classes. Lytic phages...

microbiology

Diese Sammlung zeigt die wichtigsten Werkzeuge der mikrobiologischen Forschung, einschließlich steriler Arbeitstechniken und Ausplattierung, der Verwendung von selektiven Medien und Anreicherung von Proben sowie Kultivierungsmethoden für gemischte oder reine Proben. Darüber hinaus werden gängige Methoden zur Identifizierung von mikrobiellen Isolaten sowie Verfahren zur genetischen Manipulation von Bakterien gezeigt.

Learn how E-tests and microbroth dilution measure MIC values, and how cross and non-cross setups reveal antibiotic synergy in bacteria.

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests | JoVE K12

Georgia Standards of Excellence

9-12

Biology

SB6.e

Anna Bläckberg

Rolf Lood

Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center

Lund University

Concepts

Preparation of Plates and Bacteria

Determining MIC Using E-Test

Synergy Testing: Cross Approach

Synergy Testing: Non-Cross Approach

MIC Determination Using Broth Dilution

Data Analysis: Broth Microdilution

Data Analysis and Results: Synergy Testing

Nucleic Acids and Nucleotides

Nucleic acids are the most important macromolecules for the continuity of life. They carry the cell&#39;s genetic blueprint and have instructions for its ...

Nucleic Acid Structure

The pentose sugar in DNA is deoxyribose, while in RNA the pentose sugar is ribose. The difference between the sugars is the presence of the hydroxyl group ...

DNA Base Pairing

Erwin Chargaff&#x2019;s rules on DNA equivalence paved the way for the discovery of base pairing in DNA. Chargaff&#x2019;s rules state that in a ...

From DNA to Protein

The flow of genetic information in cells from DNA to mRNA to protein is described by the central dogma, which states that genes specify the sequence of ...

The DNA Helix

Deoxyribonucleic acid, or DNA, is the genetic material responsible for passing traits from generation to generation in all organisms and most viruses. DNA ...

The Central Dogma

The central dogma explains the flow of genetic information from DNA nucleotides to the amino acid sequence of proteins.
RNA is the Missing Link Between ...

Genomic DNA in Prokaryotes

The genome of most prokaryotic organisms consists of double-stranded DNA organized into one circular chromosome in a region of cytoplasm called the ...

Genomic DNA in Eukaryotes

Eukaryotes have large genomes compared to prokaryotes. To fit their genomes into a cell, eukaryotic DNA is packaged extraordinarily tightly inside the ...

Overview

Deoxyribonucleic acid, or DNA, is the genetic material responsible for passing traits from generation to generation in all organisms and most ...

DNA Packaging

Overview

Eukaryotes have large genomes compared to prokaryotes. In order to fit their genomes into a cell, eukaryotes must pack their DNA tightly inside ...

RNA Structure

Overview
The basic structure of RNA consists of a five-carbon sugar and one of four nitrogenous bases. Although most RNA is single-stranded, it can form ...

RNA Stability

Intact DNA strands can be found in fossils, while scientists sometimes struggle to keep RNA intact under laboratory conditions. The structural variations ...

pre-mRNA Processing

In eukaryotic cells, transcripts made by RNA polymerase are modified and processed before exiting the nucleus. Unprocessed RNA is called precursor mRNA or ...

Types of RNA

Overview
Three main types of RNA are involved in protein synthesis: messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), and ribosomal RNA (rRNA). These RNAs ...

DNA as a Genetic Template

What is Gene Expression?

A gene is a stretch of DNA that serves as the blueprint for functional RNAs and proteins. Since DNA is comprised&#160; of nucleotides and proteins are ...

Transcription

Transcription is the synthesis of RNA from a DNA sequence by RNA polymerase. It is the first step in producing a protein from a gene sequence. ...

Translation

Translation is the process of synthesizing proteins from the genetic information carried by messenger RNA (mRNA). Following transcription, it constitutes ...

Ribosomes

Ribosomes translate genetic information encoded by messenger RNA (mRNA) into proteins. Both prokaryotic and eukaryotic cells have ribosomes. Cells that ...

tRNA Activation

Initiation of Translation

Termination of Translation

What are Cells?

Cell Diversity

The concept of a cell started with microscopic observations of dead cork tissue by Robert Hooke in 1665. Hooke coined the term &#34;cell&#34; based on the ...

Cells of the Epidermis

The epidermis is made of four or five layers of epithelial cells, depending on its location in the body. From deep to superficial, these layers are the ...

Bone Cells and Tissue

Bones contain a relatively small number of cells entrenched in a matrix of organic and inorganic components. Although bone cells compose only a small ...

Gross Anatomy of Skeletal Muscles

The connective tissues play a significant role in arranging the muscle fibers into a hierarchical structure that forms a complete muscle. Consider a ...

Structure of Cardiac Muscles

Cardiac muscle, or myocardium, is a specialized type of muscle found exclusively in the heart. Its unique structural and functional characteristics enable ...

structure-and-organization-of-smooth-muscles

Structure and Organization of Smooth Muscles

In the human body, smooth muscle tissue is found lining the visceral and tubular organs such as the liver, lungs, blood vessels, and respiratory tract.
...

Chromosome Replication

Before a cell can divide, it must accurately replicate all of its chromosomes, including the DNA and its associated histone and non-histone ...

Neurons: The Cell Body and the Dendrites

A typical nerve cell comprises three main components: the cell body, dendrites, and the axon. The cell body, also known as the soma or perikaryon, serves ...

Lampbrush Chromosomes

In 1882, Flemming observed lampbrush chromosomes (LBC) in salamander eggs. Later in 1892, R&#252;ckert observed LBCs in shark egg cells and coined the ...

Neurons: The Axon

The axon is a long, thin extended portion of the neuron that carries impulses from its cell body toward the effector cell.
Axoplasm, the axon&#39;s ...

Polytene Chromosomes

Polytene chromosomes are giant interphase chromosomes with several DNA strands placed side by side. They were discovered in the year 1881 by Balbiani in ...

Nervous Tissue: Neuron Types

Neurons, the fundamental units of the nervous system, can be classified based on both their structural and functional characteristics.
Structurally, ...

Euchromatin

The extent of chromatin compaction can be studied by staining chromatin using specific DNA binding dyes. Under the microscope, the dense-compacted regions ...

Nervous Tissue: Glial Cells

Glial cells or neuroglia are non-neuronal cells in the nervous system that outnumber neurons. These include astrocytes, oligodendrocytes, microglia, and ...

Heterochromatin

Lymphoid Cells and Tissues

Lymphoid cells and lymphoid tissues are the two major components of lymphoid organs.
Lymphoid cells consist of immune system cells such as B and T ...

chromatin-position-affects-gene-expression

Chromatin Position Affects Gene Expression

Chromatin is the massive complex of DNA and proteins packaged inside the nucleus. The complexity of chromatin folding and how it is packaged inside the ...

Two structural features of the DNA molecule provide a basis for the mechanisms of heredity: the four nucleotide bases and its double-stranded nature. The ...

Organization of Genes

Chromosome Structure

A functional eukaryotic chromosome must contain three elements: a centromere, telomeres, and numerous origins of replication.
The centromere is a DNA ...

Construct an explanation based on evidence for how the structure of DNA determines the structure of proteins which carry out the essential functions of life through systems of specialized cells. Emphasis is on the conceptual understanding that DNA sequences determine the amino acid sequence and thus protein structure. Students can produce scientific writing, or presentations, and/or physical models that communicate constructed explanations.

HS-LS1-1

Characteristics of Life

Biology is a natural science that studies life and living organisms, including their structure, function, development, interactions, evolution, ...

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Levels of Organization

Biological organization is the classification of biological structures, ranging from atoms at the bottom of the hierarchy to the Earth&#x27;s biosphere. ...

The Scientific Method

The scientific method is a detailed, empirical problem-solving process used by biologists and other scientists. This iterative approach involves ...

Taxonomy

Taxonomy is the science of defining and naming groups of biological organisms based on shared characteristics. It uses a hierarchy of increasingly ...

Phylogeny

Phylogeny is concerned with the evolutionary diversification of organisms or groups of organisms. A group of organisms with a name is called a taxon ...

Develop and use a model to illustrate the hierarchical organization of interacting systems that provide specific functions within multicellular organisms. Emphasis is on functions at the organism system level such as nutrient uptake, water delivery, or organism movement in response to neural stimuli. An example of an interacting system could be an artery depending on the proper function of elastic tissue and smooth muscle to regulate and deliver the proper amount of blood within the circulatory system.

HS-LS1-2

Overview of Metabolism

Living cells constantly carry out various chemical reactions which are necessary for their proper functioning. These reactions are interlinked to one ...

Regulation of Metabolism

Cellular needs and conditions vary from cell to cell and change within individual cells over time. For example, the required enzymes and energetic demands ...

Positive and Negative Feedback Loops

Animal organs and organ systems constantly adjust to internal and external changes through a process called homeostasis (&#34;steady state&#34;). Examples ...

Functions of Life

Human life is characterized by a variety of functions that are essential for survival and well-being. These functions include metabolism, movement, ...

Requirements for Human Life

The Earth and its atmosphere have provided humans with air, water, and food, but these are not the only requirements for survival. Humans also require a ...

What is Homeostasis?

Maintaining homeostasis requires that the body continuously maintain its internal conditions. Each physiological condition has a particular set point, ...

Negative and Positive Feedback

Plan and conduct an investigation to provide evidence that feedback mechanisms maintain homeostasis in living organisms. Examples of investigations could include heart rate responses to exercise, stomate responses to moisture and temperature, root development in response to water levels, or cell response to hypertonic and hypotonic environments.

HS-LS1-3

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

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