Name: calcium chloride dna uptake in e. coli
Uploaded: 2023-04-30T07:10:31.000Z
Duration: 10 min 54 s
Channel: JoVE

K12 Standards

Florida Department of Education

High School

Life Science

SC.912.L.16

SC.912.L.16.7

transformation-e-coli-cells-using-an-adapted-calcium-chloride

Transformation of E. coli Cells Using an Adapted Calcium Chloride Procedure

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung und Umwandlung des kompetenten E. coli DH5 mit Hilfe einer Anpassung des Calciumchloridverfahrens (12).
1. Einrichtung
<ol><li>
ausrüstung
	<ul>
<li>Spektrophotometer</li>
		<li>Sorval zentrifuge (oder gleichwertig)</li>
		<li>Benchtop Zentrifuge</li>
		<li>Wärmeblock oder Wasserbad</li>
		<li>Orbital Shaker</li>
		<li>Stationärer Inkubator</li>
		<li>Gelgussschale</li>
		<li>Gut Kämme</li>
		<li>Spannungsquelle</li>
		<li>Gel-Box</li>
		<li>UV-Lichtquelle</li>
		<li>mikrowelle</li>
	</ul>
</li>
	<li>
Lösungen und Reagenzien
	<ul>
<li>Luria-Bertani (LB) Brühe (10 g Kaseinenzymhydrolysat, 5 g Hefeextrakt und 5 g Natriumchlorid in 1000 mlH2O)</li>
		<li>Super optimale Brühe mit Katabolitenrepression (SOC): (2% (w/v) Trypton, 0,5% (w/v) Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4und 20 mM Glukose)</li>
		<li>CaCl2-MgCl2 (80 mM MgCl2, 20 mM CaCl2) Lösung.</li>
		<li>M CaCl2 Lösung (wenn Zellen sofort transformiert werden) oder 0,1M CaCl2 Lösung mit 10% (v/v) Glycerin (wenn Zellen für die zukünftige Verwendung eingefroren werden).</li>
		<li>LB AgarPlatten</li>
		<li>LB Agar selektive Platten (für dieses Experiment, da das verwendete Plasmid konfers Ampicillin-Resistenz, LB-Agar-Platten mit Ampicillin 100 g/ml verwendet wurden)</li>
		<li>
E. coli DH5-Stamm</li>
		<li>Plasmid pUC19 DNA (100 pg/ l)</li>
		<li>QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen)</li>
		<li>
Hind III-Restriktionsenzym</li>
		<li>1 kb plus DNA-Leiter</li>
		<li>Niedriger Schmelzpunkt Agarose</li>
		<li>1X TAE Puffer (40 mM Tris Base, 20 mMM Essigsäure und 1mM EDTA)</li>
		<li>Ethidiumbromid (10mg/ml)</li>
	</ul>
</li>
	<li>
Allgemeine Sicherheitshinweise E. coli DH5 wird als Biosafety Level 1 (BSL1) klassifiziert. Mikroben in dieser Kategorie stellen bei gesunden Erwachsenen wenig bis gar keine Infektionsgefahr dar. Eine sorgfältige Manipulation des Mikroorganismus ist jedoch erforderlich.</li>
</ol>WICHTIG alle Schritte in diesem Protokoll müssen mit aseptischen Techniken und auf Eis oder 4°C Temperaturen durchgeführt werden, sofern nicht angegeben.
2. Protokoll
<ol><li>Aus einem gefrorenen Vorrat an E. coli DH5 (gefroren in 20% Glycerin aus einer über Nacht kultur in LB angebaut) streifen Bakterien für die Isolierung auf einer LB Agarplatte. Inkubieren Bei 37°C über Nacht (16-20 Stunden).</li>
	<li>Impfen Sie eine einzelne Kolonie in 3 ml LB-Brühe in einer Röhre. Schütteln bei 210 Rpm bei 37°C über Nacht (16-20 Stunden).</li>
	<li>Messen Sie die OD600 der Übernachtungskultur. Verwenden Sie die Nachtkultur, um 100 ml LB-Brühe in einem 1-Liter-Kolben zu einem OD600=0.01 zu impfen. Bebrüte die Kultur kräftig (210 Rpm) bei 37°C und überwacht OD600 im Spektralphotometer alle 15-20 min, bis die Kultur OD600=0,35 (ca. 3 Stunden) erreicht. HINWEIS: Damit die Transformation effizient ist, müssen sich Bakterienzellen in einer mittleren exponentiellen Wachstumsphase befinden. Die maximale Anzahl der Zellen muss 108 Zellen/ml betragen, was für die meisten Stämme von E. coli OD600=0.4 entspricht. Die Verwendung des Spektralphotometers ermöglicht die Messung des OD600, wodurch festgestellt werden kann, dass sich die Zellen in der entsprechenden Wachstumsphase befinden. Wenn dieses Protokoll für andere Bakterienstämme verwendet wird, ist eine Kalibrierung erforderlich, um die Anzahl der Kolonien zu bestimmen, die Einheiten zu bestimmten OD600-Werten bilden, um diese Korrelation zu bestimmen.</li>
	<li>Übertragen Sie die 50 ml der Kultur auf jede der 2 eiskalten Polypropylen-Zentrifugenflaschen. Die Flaschen 20 min auf Eis legen, um sie abzukühlen.</li>
	<li>Die Zellen durch Zentrifugation bei 2700g (4100 U/min in einem Sorval GSA Rotor) für 10 min bei 4°C wiederherstellen.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand. Entleeren Sie die letzten Medienspuren, indem Sie die Flasche kopfüber auf ein Pad oder Papiertuch legen.</li>
	<li>Setzen Sie jedes bakterielle Pellet in 30 ml einer CaCl2-MgCl2 (80 mM MgCl2, 20 mM CaCl2) eiskalte Lösung aus. Zuerst 5 ml der Lösung hinzufügen, vorsichtig wirbeln, bis sich das Pellet vollständig aufgelöst hat, und dann die restlichen 25 ml Lösung hinzufügen.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 2.4.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 2.5.</li>
	<li>Wenn kompetente Zellen direkt umgewandelt werden, setzen Sie jedes bakterielle Pellet in 2 ml einer ca.2 (0,1 m) eiskalten Lösung aus, indem Sie die Rohre vorsichtig wirbeln. Wenn das Pellet mit dieser Methode nicht resuspendiert wird, resuspendieren Sie durch sanftes Pipettieren nach oben und unten (Vermeidung von Blasenbildung). Alternativ können die kompetenten Zellen eingefroren und zur späteren Verwendung gelagert werden. Um gefrorene Bestände kompetenter Zellen zu zuzubereiten, setzen Sie das Pellet in 2 ml einer 0,1 Mio.CaCl2-Lösung mit 10 % (v/v) Glycerin wieder aus. Diese Lösung muss eiskalt sein. Aliquot-Zellsuspension in eiskalte 1,5 ml Polypropylenröhren (160 l pro Röhre). Kompetente Zellen sofort in einem Trockeneis/Ethanolbad einfrieren. Rohre in einen -70°C Gefrierschrank übertragen.</li>
	<li>Um die CaCl2-behandeltenZellen zu transformieren, übertragen Sie 50 l kompetente Zellen auf jeweils 2 1,5 ml Polypropylen-Röhrchen. Fügen Sie die 1 l (100 pg) pUC19 Plasmid-DNA in eines der Röhrchen hinzu und lassen Sie die zweite Röhre ohne DNA (negative Kontrolle). Mischen Sie sanft (Blasenbildung vermeiden). 30 min auf Eis bebrüten. HINWEIS: Bei der Transformation sollten nicht mehr als 50 ng DNA in einem Volumen von 10 l oder weniger verwendet werden.</li>
	<li>Übertragen Sie die Rohre auf den Wärmeblock und inkubieren Bei 42°C für 45 s genau. HINWEIS: Hitzeschock ist ein kritischer Schritt. Temperatur oder Inkubationszeit nicht überschreiten.</li>
	<li>Rohre leicht auf Eis übertragen. Inkubieren Sie für 2 min.</li>
	<li>Fügen Sie 950 L SOC-Medien hinzu und inkubieren Sie die Röhren 1 Stunde bei 37°C, damit sich die Bakterien erholen und den im Plasmid kodierten antibiotikaresistenten Marker ausdrücken können.</li>
	<li>Verdünnung von 10 l der Zellsuspension in 1000 l in SOC (1/100 Verdünnung) und 100 l der Zellsuspension in 1000 l in SOC (1/10 Verdünnung). Platte 100 l der Verdünnungen sowie die Kontrolle auf selektive Platten und mit einem Spachtel verteilen. In der Regel ergibt die Beschichtung von 100 l einer Verdünnung von 1/100 und 1/10 eine ausreichende Anzahl von koloniebildenden Einheiten (cfu) pro Platte. Idealerweise sollte diese Zahl zwischen 30-300 cfu liegen, so dass es genügend Kolonien gibt, aber voneinander getrennt sind. Die Anzahl der cfu hängt jedoch von der Transformationseffizienz ab (siehe Abschnitt Datenanalyse und Ergebnisse).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platten bei 37°C. Transformierte Kolonien sollten in 12-16 Stunden erscheinen (dieser Bereich hängt von der Zellstamm- und Selektionsmethode ab). Keine Kolonien sollten in der negativen Kontrolle wachsen.</li>
	<li>Zählen Sie die für die Transformation erhaltene cfu/platte (Tabelle 1).</li>
	<li>Um zu überprüfen, ob die Transformanten das pUC19-Plasmid enthalten, wird ein Plasmidpräparat und eine anschließende Verdauung durchgeführt. Zu diesem Zweck eine einzelne Kolonie in 3 ml LB-Brühe in einer Röhre impfen. Schütteln bei 210 Rpm bei 37°C über Nacht (16-20 Stunden).</li>
	<li>Bereiten Sie ein Plasmid-Präparat mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit nach den Anweisungen des Herstellers vor.</li>
	<li>Verdauen Sie die 1 g gereinigte pUC19 mit dem Restriktionsenzym HindIII bei 37°C für 1 Stunde. HINWEIS: Für diesen Schritt kann jedes Enzym verwendet werden, das die mehrfache Klonstelle pUC19 schneidet.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>teil</td>
			<td>betrag</td>
		</tr>
<tr>
<td>10X Einschränkung Digest-Puffer</td>
			<td>2,5 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Plasmid pUC19</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Hind Ⅲ</td>
			<td>1 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>20,5 l (bis 25 l)</td>
		</tr>
</tbody></table><ol start="21"><li>Führen Sie eine Molekulargewichtsleiter, verdaute pUC19-DNA und die gleiche Menge an unverdauter pUC19-DNA in einem 1% Agarose-Gel, das 1 g/ml Ethidiumbromid enthält, 1 Stunde lang bei 95 V. HINWEIS: Zeit und Spannung variieren je nach verwendeter Ausrüstung.</li>
	<li>Visualisieren Sie Gel unter UV-Licht. Vergleichen Sie die Größe der verdauten und unverdauten pUC19-DNA (Abbildung 2) (siehe Abschnitt Datenanalyse und Ergebnisse). Fahren Sie mit den erforderlichen Schritten fort, um die Transformation entsprechend dem Ziel jedes einzelnen Transformationsexperiments zu überprüfen.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10515/10515fig2.jpg"> Abbildung 2: Verdauung der wiedergewonnenen Plasmid-DNA aus transformierten DH5-Zellen. Plasmid-DNA wurde aus transformierten DH5-Zellen, die mit HindIII verdaut, in einem 1% Agarose-Gel verdaute und mit einer UV-Quelle visualisiert wurden (Schritte 2.19 bis 2.22), wiederhergestellt.
3. Datenanalyse und Ergebnisse
Um die Transformationseffizienz zu berechnen, ein Indikator dafür, wie gut die Zellen die extrazelluläre DNA aufgriffen, müssen die kolonien gezählt werden, die bei der Transformation erhalten wurden:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>verdünnung</td>
			<td>Cfu</td>
		</tr>
<tr>
<td>1/100</td>
			<td>34</td>
		</tr>
<tr>
<td>1/10</td>
			<td>246</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Koloniebildnereinheiten (cfu) aus Transformationsexperiment gezählt.
Die Transformationseffizienz (TE) ist ein Maß für die Anzahl der cfu, die sich aus der Umwandlung von 1 g Plasmid in ein bestimmtes Volumen kompetenter Zellen ergibt. Viele Parameter beeinflussen die Transformationseffizienz: Plasmidgröße, Zellgenotyp, Wachstumsstadium bei der Kompetenzvorbereitung, Transformationsmethoden usw.). Bei der Berechnung des TE ist es wichtig zu berücksichtigen, welche Verdünnung (falls vorhanden) vor der Beschichtung durchgeführt wurde, und sie in die Berechnung der Gesamtzahl der Cfu einzubeziehen. Die Transformationseffizienz (TE) wird mit der folgenden Gleichung berechnet:
<img src="/files/ftp_upload/10515/10515eq1.jpg">
Teilen Sie zunächst den Cfu durch die DNA, in diesem Beispiel 0,0001 g. Dividieren Sie dann das Ergebnis durch den Verdünnungsfaktor. In diesem Beispiel wurde eine Verdünnung von 1/10 und 100 l einer 1 ml-Lösung plattiert (Verdünnung: 1/10 x 100 l /1000 l =0,01).
<img src="/files/ftp_upload/10515/10515eq2.jpg">

Transformation ist eine leistungsfähige Methode zur Einführung von exogener DNA in Bakterienzellen, die für viele molekularbiologische Anwendungen im Labor von entscheidender Bedeutung ist. Darüber hinaus spielt es eine wichtige Rolle in der Natur, indem es Bakterienzellen erlaubt, genetisches Material auszutauschen, was zu einer erhöhten genetischen Variation führen und den Erwerb verschiedener nützlicher Merkmale für das Überleben unter einer Vielzahl von Bedingungen ermöglichen könnte. Viele Bakterienstämme kodieren d...

transformation von e. coli-zellen mit einem adaptierten calciumchlorid-verfahren

Quelle: Natalia Martin1, Andrew J. Van Alst1, Rhiannon M. LeVeque1, und Victor J. DiRita1 1 Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University
Bakterien haben die Fähigkeit, genetisches Material (DeoxyriboNucleic Acid, DNA) in einem Prozess auszutauschen, der als horizontaler Gentransfer bekannt ist. Die Einbeziehung exogener DNA bietet einen Mechanismus, mit dem Bakterien neue genetische Merkmale erwerben können, die es ihnen ermöglichen, sich an sich verändernde Umweltbedingungen anzupassen, wie das Vorhandensein von Antibiotika oder Antikörpern (1) oder Molekülen, die in natürlichen Lebensräumen gefunden werden (2). Es gibt drei Mechanismen des horizontalen Gentransfers: Transformation, Transduktion und Konjugation (3). Hier konzentrieren wir uns auf transformation, die Fähigkeit von Bakterien, freie DNA aus der Umwelt zu nehmen. Im Labor hat der Transformationsprozess vier allgemeine Schritte: 1) Vorbereitung kompetenter Zellen, 2) Inkubation kompetenter Zellen mit DNA, 3) Wiederherstellung der Zellen und 4) Beschichtung der Zellen für das Wachstum der Transformanten (Abbildung 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10515/10515fig1.jpg"> Abbildung 1: Allgemeine Schritte des Transformationsprozesses. Der Transformationsprozess besteht aus vier allgemeinen Schritten: 1) Vorbereitung kompetenter Zellen, 2) Inkubation mit DNA, 3) Wiederherstellung der Zellen und 4) Beschichtungszellen für das Wachstum der Transformanten.
Damit die Transformation stattfindet, müssen sich die Empfängerbakterien in einem Zustand befinden, der als Kompetenz bekannt ist. Einige Bakterien haben die Fähigkeit, natürlich kompetent als Reaktion auf bestimmte Umweltbedingungen zu werden. Jedoch, viele andere Bakterien werden nicht kompetent natürlich, oder die Bedingungen für diesen Prozess sind noch unbekannt. Die Fähigkeit, DNA in Bakterien einzuführen, hat eine Reihe von Forschungsanwendungen: mehrere Kopien eines DNA-Moleküls von Interesse zu erzeugen, eine große Menge an Proteinen auszudrücken, als Bestandteil in Klonverfahren, und andere. Aufgrund des Wertes der Transformation zur Molekularbiologie gibt es mehrere Protokolle, die darauf abzielen, Zellen künstlich kompetent zu machen, wenn Bedingungen für natürliche Kompetenz unbekannt sind. Zwei Hauptmethoden werden verwendet, um künstlich kompetente Zellen vorzubereiten: 1) durch chemische Behandlung von Zellen und 2) Die Zellen elektrischen Impulsen aussetzen (Elektroporation). Erstere verwendet je nach Verfahren unterschiedliche Chemikalien, um Anziehungskraft zwischen der DNA und der Zelloberfläche zu erzeugen, während letztere elektrische Felder verwendet, um Poren in der bakteriellen Zellmembran zu erzeugen, durch die DNA-Moleküle eindringen können. Der effizienteste Ansatz für die chemische Kompetenz ist die Inkubation mit divalenten Kationen, insbesondere Kalzium (Ca2+)(4,5) Calcium-induzierte Kompetenz ist das Verfahren, das hier beschrieben wird (6). Diese Methode wird hauptsächlich für die Transformation von Gram-negativen Bakterien verwendet, und das wird der Schwerpunkt dieses Protokolls sein.
Das Verfahren der chemischen Umwandlung umfasst eine Reihe von Schritten, in denen Zellen Kationen ausgesetzt sind, um chemische Kompetenz zu induzieren. Auf diese Schritte folgt anschließend eine Temperaturänderung - Hitzeschock -, die die Aufnahme fremder DNA durch die zuständige Zelle begünstigt (7). Die bakteriellen Zellhüllen sind negativ geladen. Bei gramnegativen Bakterien wie Escherichia coliist die äußere Membran aufgrund des Vorhandenseins von Lipopolysaccharid (LPS) negativ geladen (8). Dies führt zur Abstoßung der ähnlich negativ geladenen DNA-Moleküle. In der chemischen Kompetenzinduktion neutralisieren positiv geladene Calciumionen diese Ladungsabstoßung und ermöglichen die DNA-Absorption auf die Zelloberfläche (9). Die Kalziumbehandlung und Inkubation mit DNA erfolgt auf Eis. Anschließend wird eine Inkubation bei höheren Temperaturen (42°C), dem Hitzeschock, durchgeführt. Dieses Temperaturungleichgewicht begünstigt die DNA-Aufnahme weiter. Bakterielle Zellen müssen sich in der mittleren exponentiellen Wachstumsphase befinden, um der Hitzeschockbehandlung standzuhalten; in anderen Wachstumsstadien sind die Bakterienzellen zu empfindlich gegenüber der Hitze, was zu einem Verlust der Lebensfähigkeit führt, was die Transformationseffizienz deutlich verringert.
Für die Transformation können verschiedene DNA-Quellen verwendet werden. Typischerweise werden Plasmide, kleine kreisförmige, doppelsträngige DNA-Moleküle, für die Transformation in den meisten Laborverfahren in E. coli verwendet. Damit Plasmide nach der Transformation in der Bakterienzelle erhalten bleiben können, müssen sie einen Ursprung der Replikation enthalten. Dadurch können sie unabhängig vom bakteriellen Chromosom in der Bakterienzelle repliziert werden. Nicht alle Bakterienzellen werden während des Transformationsvorgangs transformiert. So ergibt die Transformation eine Mischung aus transformierten Zellen und nicht transformierten Zellen. Um zwischen diesen beiden Populationen zu unterscheiden, wird eine Selektionsmethode verwendet, um die Zellen zu identifizieren, die das Plasmid erworben haben. Plasmide enthalten in der Regel wählbare Marker, d. h. Gene, die eine Eigenschaft kodieren, die einen Vorteil für das Wachstum verleiht (d. h. Resistenz gegen ein Antibiotikum oder eine Chemikalie oder Rettung aus einer Wachstumsauxotrophie). Nach der Transformation werden Bakterienzellen auf selektiven Medien plattiert, was nur das Wachstum der transformierten Zellen ermöglicht. Im Falle von Zellen, die mit einem Plasmid transformiert werden, das eine Resistenz gegen ein bestimmtes Antibiotikum verleiht, werden die selektiven Medien Wachstumsmedien sein, die dieses Antibiotikum enthalten. Verschiedene Methoden können verwendet werden, um zu bestätigen, dass die in den selektiven Medien angebauten Kolonien Transformanten sind (d.h. das Plasmid eingebaut haben). Beispielsweise können Plasmide aus diesen Zellen mit Plasmidpräparationsmethoden (10) zurückgewonnen und verdaut werden, um die Plasmidgröße zu bestätigen. Alternativ kann Kolonie-PCR verwendet werden, um das Vorhandensein des Plasmids von Interesse zu bestätigen (11).
Ziel dieses Experiments ist es, chemisch kompetente E. coli DH5-Zellen unter Verwendung einer Anpassung des Calciumchloridverfahrens (12) vorzubereiten und mit dem Plasmid pUC19 zu transformieren, um die Transformationseffizienz zu bestimmen. Der E. coli-Stamm DH5 ist ein häufig verwendeter Stamm in molekularbiologischen Anwendungen. Aufgrund seines Genotyps, insbesondere des recA1 und des endA1,ermöglicht dieser Stamm eine erhöhte Insert-Stabilität und verbessert die Qualität der Plasmid-DNA in nachfolgenden Präparaten. Da die Transformationseffizienz mit zunehmender Größe der DNA abnimmt, wurde das Plasmid pUC19 in diesem Protokoll wegen seiner geringen Größe (2686 bp) verwendet (siehe https://www.mobitec.com/cms/products/bio/04_vector_sys/standard_cloning_vectors.html für eine Vektorkarte). pUC19 verleiht Resistenz gegen Ampicillin und somit war dies das Antibiotikum, das zur Selektion verwendet wurde.

Obwohl TE von vielen Faktoren abhängig ist, ergeben nicht-kommerzielle, kompetente Zellpräparate wie dieser normalerweise 106 bis 107 Transformanten pro Mikrogramm Plasmid. Daher ergab diese Zubereitung mit einem TE = 2,46 x 108 cfu/g einen TE, der weit über den erwarteten Bereich hinausging. Zusätzliche Protokolle stehen zur Verfügung, um überkompetente Zellen herzustellen, wenn für eine bestimmte Anwendung höhere Transformationseffizienzen erforderlich s...

Transformation von E. coli-Zellen mit einem adaptierten Calciumchlorid-Verfahren

Source: Natalia Martin1, Andrew J. Van Alst1, Rhiannon M. LeVeque1, and Victor J. DiRita1
1 Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan ...

Bakterien sind bemerkenswert anpassungsfähig und ein Mechanismus, der diese Anpassung erleichtert, ist ihre Fähigkeit, externe DNA-Moleküle aufzunehmen. Eine Art von DNA, die Bakterien aufnehmen können, wird als Plasmid bezeichnet, ein kreisförmiges DNA-Stück, das häufig nützliche Informationen enthält, wie z. B. Antibiotikaresistenzgene. Der Prozess, bei dem Bakterien durch neue genetische Informationen verändert werden, die aus einer externen Quelle stammen, wird als Transformation bezeichnet. Die Umwandlung kann leicht im Labor mit Escherichia coli oder E. coli durchgeführt werden. Um transformiert zu werden, müssen E. coli-Zellen zunächst kompetent gemacht werden, d.h. sie müssen in der Lage sein, DNA-Moleküle aus ihrer Umgebung aufzunehmen. Das Protokoll, um dies zu erreichen, ist überraschend einfach: eine kurze Inkubation der Zellen in einer Kalziumchloridlösung. Diese Inkubation bewirkt, dass die Zellen für DNA-Moleküle durchlässig werden. Nachdem die Zellen durch Zentrifugation pelletiert wurden, wird der Überstand entfernt. Die Plasmid-DNA wird nun den zuständigen Zellen zugeführt. Nach der Inkubation der Zellen mit DNA wird die Mischung kurz auf 42 Grad Celsius erhitzt, gefolgt von einer schnellen Abkühlung auf Eis. Dieser Hitzeschock führt dazu, dass die DNA über die Zellwand und die Membranen übertragen wird. Die Zellen werden dann in frischen Medien inkubiert. Dann werden die Bakterien in einem Winkel von 37 Grad platziert, damit sie ihre Membranen wieder verschließen und resistente Proteine exprimieren können. Die Zellen, die die Plasmide aufgenommen haben, kopieren die DNA originalgetreu und geben sie an ihre Nachkommen weiter und exprimieren alle Proteine, die von ihr kodiert werden könnten, einschließlich Antibiotikaresistenzmediatoren. Diese Resistenzgene können als selektierbare Marker verwendet werden, um Bakterien zu identifizieren, die erfolgreich transformiert wurden, da Zellen, die das Plasmid nicht aufgenommen haben, das Produkt des Resistenzgens nicht exprimieren. Das bedeutet, dass, wenn die Zellen auf ein festes Medium aufgetragen werden, das das entsprechende Antibiotikum enthält, nur Zellen wachsen, die das Plasmid aufgenommen haben. Die Transformation der Zellen in einer wachsenden Kolonie kann weiter bestätigt werden, indem diese Zellen über Nacht in flüssigen Medien kultiviert werden, um die Ausbeute zu erhöhen, bevor die DNA aus der Probe extrahiert wird. Sobald die DNA isoliert ist, kann ein diagnostischer Restriktionsenzymverdau durchgeführt werden. Da Restriktionsenzyme DNA an vorhersagbaren Stellen schneiden, sollte das Ausführen dieser Verdaue auf einem Gel ein vorhersagbares Muster zeigen, wenn das gewünschte Plasmid erfolgreich transformiert wurde. Wenn beispielsweise pUC19 mit dem Restriktionsenzym HindIII hergestellt und geschnitten wird, sollte eine einzelne Bande von 2686 Nukleotiden auf dem Gel zu sehen sein. In diesem Labor transformieren Sie den E. coli-Stamm DH-5 Alpha mit pUC19 und bestätigen dann die erfolgreiche Transformation durch DNA-Gelelektrophorese. Ziehen Sie vor Beginn des Eingriffs die entsprechende persönliche Schutzausrüstung an, einschließlich eines Laborkittels und Handschuhe. Als nächstes sterilisieren Sie den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol. Bereiten Sie nun chemisch kompetente Zellen vor, indem Sie eine Schlinge voller Bakterien auf eine sterile LB-Agarplatte legen und die Bakterien mit einer neuen Schlaufe bestreichen. Inkubieren Sie die Platte dann über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag sterilisieren Sie die Tischplatte erneut mit 70% Ethanol und nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator. Impfen Sie eine einzelne, gut isolierte Kolonie in 3 Milliliter LB-Brühe in einem Röhrchen mit steriler Schlaufe. Lassen Sie die Kultur dann über Nacht bei 37 Grad Celsius wachsen, wobei Sie sie bei 210 U/min schütteln. Messen Sie am nächsten Tag die optische Dichte der Übernachtkultur mit einem Spektralphotometer. Geben Sie dann 100 Milliliter LB-Brühe in einen Ein-Liter-Kolben und beimpfen Sie ihn mit der Nachtkultur bei einer optischen Dichte von 0. 01. Inkubieren Sie nun die Kultur bei 37 Grad Celsius unter Schütteln und überprüfen Sie den OD600 alle 15 bis 20 Minuten, bis die Kultur die mittlere exponentielle Wachstumsphase erreicht. Nach etwa drei Stunden füllst du 50 Milliliter der Kultur in zwei eiskalte Polypropylenflaschen um. Stellen Sie die Flaschen dann zum Abkühlen wieder für 20 Minuten auf Eis. Als nächstes gewinnen Sie die Zellen durch Zentrifugation. Entsorgen Sie die Überstände und legen Sie die Flaschen kopfüber auf ein Papiertuch. Anschließend das Bakterienpellet in fünf Millilitern eiskalter Calciumchlorid-Magnesiumchlorid-Lösung resuspendieren und vorsichtig schwenken, bis sich das Pellet vollständig aufgelöst hat. Geben Sie dann weitere 25 Milliliter der Lösung zu dem aufgelösten Bakterienpellet. Suspendieren Sie das andere Bakterienpellet wie zuvor gezeigt. Wiederholen Sie danach die Zentrifugation und entfernen Sie die Überstände. Wenn die zuständigen Zellen direkt umgewandelt werden sollen, resuspendieren Sie jedes Bakterienpellet in zwei Millilitern einer eiskalten 0,1-molaren Calciumchloridlösung, indem Sie die Röhrchen vorsichtig schwenken. Um den Transformationsvorgang zu starten, werden 50 Mikroliter kompetenter Zellen in zwei markierte 1,5-Milliliter-Polypropylenröhrchen überführt. Geben Sie dann einen Mikroliter pUC19-Plasmid-DNA in eines der Röhrchen. Vorsichtig mischen, Blasenbildung vermeiden, und beide Röhrchen 30 Minuten auf Eis inkubieren. Nach der Inkubation werden die Röhrchen in einen Heizblock umgefüllt und 45 Sekunden lang bei 42 Grad Celsius inkubiert. Setzen Sie die Röhrchen sofort auf Eis und inkubieren Sie sie zwei Minuten lang. Geben Sie nun 950 Mikroliter SOC-Medien in jedes Röhrchen und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius, damit sich die Bakterien erholen und den im Plasmid kodierten antibiotikaresistenten Marker exprimieren können. Um eine Verdünnung von 1 bis 100 zu erzielen, geben Sie 990 Mikroliter SOC-Medien und 10 Mikroliter Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Nehmen Sie dann eine Verdünnung von 1 bis 10 vor, indem Sie 900 Mikroliter SOC-Medien und 100 Mikroliter Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen geben. Als nächstes werden 100 Mikroliter der verdünnten Zellsuspensionen und 100 Mikroliter der Negativkontrolle mit einem Spreader auf separate selektive Platten mit Ampicillin aufgefüllt und die Platten 12 bis 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Zählen Sie nach der Inkubation die koloniebildenden Einheiten (KBE) pro Platte, die durch die Transformation erhalten wurden, und notieren Sie diese Daten. Um zu überprüfen, ob die Transformanten das pUC19-Plasmid enthalten, wählen Sie eine einzelne, gut isolierte Kolonie aus einer Platte mit einer sterilen Schleife und geben Sie sie in ein Röhrchen mit 3 Millilitern LB-Brühe. Inkubieren Sie die Kultur dann bei 37 Grad Celsius unter Schütteln über Nacht. Verwenden Sie am nächsten Tag ein DNA-Mini-Vorbereitungskit, um DNA aus 3 Millilitern der Kultur gemäß den Anweisungen des Herstellers zu isolieren. Nach Abschluss der DNA-Minivorbereitung verdauen Sie das 1 Mikrogramm gereinigtes pUC19 mit einem Restriktionsenzym bei 37 Grad Celsius für 1 Stunde. Laden Sie nun 20 Mikroliter einer Molekulargewichtsleiter, 1 Mikrogramm verdaute Plasmid-DNA und 1 Mikrogramm unverdaute Plasmid-DNA in aufeinanderfolgende Vertiefungen eines 1%igen Agarosegels, das 1 Mikrogramm pro Milliliter Ethidiumbromid enthält. Lassen Sie das Gel dann 1 Stunde lang bei 95 Volt laufen. Zum Schluss visualisieren Sie das Gel mit einem UV-Strahler. In diesem Experiment wurden chemisch kompetente E. coli DH5 Alpha-Zellen unter Verwendung einer Adaption des Calciumchlorid-Verfahrens hergestellt und dann mit dem Plasmid pUC19 transformiert, um die Transformationseffizienz zu bestimmen. Um die Transformationseffizienz zu berechnen, verwenden Sie die aufgezeichneten KBE-Zahlen für die Verdünnungen von 1 zu 100 und 1 zu 10 sowie alle anderen Verdünnungen mit einer KBE-Zahl zwischen 30 und 300. Zuerst wird die aufgezeichnete KBE-Anzahl, in diesem Beispiel 246, durch die Menge an DNA dividiert, die hier 0,0001 Mikrogramm plattiert wurde. Dann wird diese Zahl durch den Verdünnungsfaktor dividiert, der verwendet wird, um die Transformationseffizienz in KBE pro Mikrogramm anzugeben. In diesem Beispiel wurde eine Verdünnung von 1 bis 10 verwendet und 100 Mikroliter einer 1-Milliliter-Lösung plattiert, was einen endgültigen Verdünnungsfaktor von 0,01 ergibt. In der unverdauten Plasmidspur kann die zirkuläre DNA als zwei oder drei verschiedene Banden unterschiedlicher Helligkeit erscheinen. Dies liegt daran, dass die zirkuläre, ungeschnittene DNA in mehreren verschiedenen Konformationszuständen vorliegen kann, z. B. supercoiled, offener Kreis oder linearer, und jeder von ihnen bewegt sich mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten durch das Gel. Die Analyse des gefundenen Plasmid-DNA-Verdaus zeigte, dass das verwendete Plasmid eine erwartete Größe von pUC19-DNA (2.686 Basenpaare) aufweist.

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Lehre

JoVE Science Education

Advanced Biology

Fortgeschrittene Biologie

Microbiology

Mikrobiologie

calcium chloride dna uptake in e. coli

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency.

Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation. Transformation is the process in which bacteria take up free DNA from the environment. In the lab, it usually includes four steps: preparing competent cells, mixing cells with DNA, recovering the cells, and plating them so transformants can grow.

For transformation to occur, cells must be competent, which means they can take in DNA. Some bacteria become naturally competent under certain conditions. Others do not, or the conditions are not known. For that reason, scientists often make cells artificially competent. Two common approaches are chemical treatment and electroporation, which uses electric pulses to open pores in the cell membrane.

This protocol uses calcium ions, especially Ca2+, to create chemical competence. It is mainly used with Gram-negative bacteria. E. coli cells and their outer membrane carry negative charge, and DNA is also negatively charged. Calcium helps neutralize this repulsion so DNA can attach to the cell surface. The cells and DNA are kept on ice during this step, and then a heat shock at 42°C helps drive DNA into the cells.

The cells must be in mid-exponential growth phase before heat shock. At other growth stages, they are more sensitive to heat and may lose viability. That lowers transformation efficiency. The DNA used for transformation is usually a plasmid, which is a small circular double-stranded DNA molecule. To stay in the cell after transformation, the plasmid must have an origin of replication so it can copy itself independently of the bacterial chromosome.

Not every cell becomes transformed, so the result is a mix of transformed and non-transformed cells. To find the cells that received the plasmid, the procedure uses selection. Plasmids often carry selectable markers, such as antibiotic resistance genes or genes that rescue a growth need. After transformation, the cells are plated on selective media. In this case, the media contains ampicillin, which allows only the transformed cells to grow.

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

creating a winogradsky column: a method to enrich the microbial species in a sediment sample

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Winogradsky Column Microbial Layers and Gradients

A Winogradsky column shows how microbial layers form in mud and water over time. It is a clear, enclosed ecosystem that helps scientists grow sediment microbes that are hard to culture in a test tube or on a petri dish. By keeping conditions close to a microbe’s natural habitat, the column makes it possible to study organisms that help drive Earth’s biogeochemical cycles. The column is built from pond or wetland sediment mixed with water in a transparent container. Extra sources of carbon,...

serial dilutions and plating: microbial enumeration

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Counting Bacteria with Dilution Plates

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs. Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed...

enrichment cultures: culturing aerobic and anaerobic microbes on selective and differential medias

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Selective Media for Bacterial Isolation

Selective media help scientists isolate bacteria by supporting some microbes and blocking others. This lab also uses differential media, which reveal a visible chemical trait in the organism being grown. Together, these methods help identify bacteria from mixed samples. Prokaryotic cells live in almost every environment on Earth. They also show wide metabolic diversity, so the growth medium must supply the molecules they need for energy. Some microbes are extremophiles, meaning they live in...

pure cultures and streak plating: isolation of single bacterial colonies from a mixed sample

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Streak Plate Method for Isolating Bacteria

The streak plate method is used to isolate single bacterial colonies from a mixed sample. It helps separate one bacterial type from another so a pure culture can be grown. This is important in both clinical and research settings, where bacteria often grow together in mixed cultures. Pure cultures are needed for later genetic and protein studies. They are also used to check whether a sample is pure and to identify infectious agents from clinical samples. Because different strains can affect...

16s rrna sequencing: a pcr-based technique to identify bacterial species

16s-rrna-sequencing-pcr-based-technique-to-identify-bacterial

Bacterial ID with 16S rRNA Gene Sequencing

Bacterial identification with 16S rRNA gene sequencing helps scientists tell bacterial species apart. It is used in microbial ecology to study biodiversity in environmental samples and in medical microbiology to help diagnose infected patients. Traditional methods include microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays. Molecular methods have changed how bacteria are identified. 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing is often faster...

growth curves: generating growth curves using colony forming units and optical density measurements

growth-curves-generating-growth-curves-using-colony-forming-units

Bacterial Growth Stages and Cell Counts

Bacterial growth stages and cell counts show how a culture changes over time. This page follows a batch culture as it moves through lag, exponential, stationary, and death phases. It also shows how colony forming units, or CFU, and optical density can be used to measure that growth. Lag phase is the time bacteria need to adjust to a new environment before fast division begins. During exponential phase, cells grow and divide at the fastest rate, and DNA replication, RNA transcription, and...

antibiotic susceptibility testing: epsilometer tests to determine mic values of two antibiotics and evaluate antibiotic synergy

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Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform. The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with...

microscopy and staining: gram, capsule, and endospore staining

microscopy-and-staining-gram-capsule-and-endospore-staining

Bacterial Stains for Cell Walls and Spores

Bacterial stains help scientists see cell walls, capsules, and endospores with a compound light microscope. Many bacteria are hard to tell apart with light alone because they are small, colorless, and can look similar under the lens. Staining makes these hidden features visible and helps identify different bacteria. A compound microscope uses more than one lens to magnify a sample. Its objective lens collects light near the specimen, and the eyepiece enlarges the image. Many compound...

plaque assay: a method to determine viral titer as plaque forming units (pfu)

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Phage Plaque Test for Counting Viruses

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect prokaryotic cells. The plaque assay is a classic way to count these viruses by measuring viral titer, which is the amount of virus in a sample. It was first described in 1952 and is still one of the most reliable methods for determining viral titer. Phages were identified in the early 20th century by Twort and d'Hérelle. They have since been recognized for their therapeutic value and for their role in human and global ecosystems. Interest in...

transformation of e. coli cells using an adapted calcium chloride procedure

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency. Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation.

conjugation: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

conjugation-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from-donor-to

Bacterial Gene Transfer by Conjugation in E. coli

Bacterial conjugation is a form of horizontal gene transfer in E. coli that moves DNA from one cell to another through direct contact. It was first discovered by Lederberg and Tatum in 1946. Unlike transformation or transduction, conjugation is a natural, one-way transfer of DNA from a donor cell to a recipient cell. This process can increase bacterial genetic diversity. It is often described as a type of bacterial mating. It has also helped drive the spread of antibiotic-resistant bacteria.

phage transduction: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

phage-transduction-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from

Using P1 Phage to Move Antibiotic Resistance in E. coli

Bacteriophage transduction moves DNA between bacteria by using a phage, or bacterial virus, as the carrier. In this process, a phage can deliver genetic material from one bacterium to another. The method is a form of horizontal gene transfer and is important in both bacterial evolution and laboratory genetics. Phages were first described in the early 1900s, and transduction was named in 1951 by Norton Zinder and Joshua Lederberg. The transcript describes two main phage classes. Lytic phages...

microbiology

Diese Sammlung zeigt die wichtigsten Werkzeuge der mikrobiologischen Forschung, einschließlich steriler Arbeitstechniken und Ausplattierung, der Verwendung von selektiven Medien und Anreicherung von Proben sowie Kultivierungsmethoden für gemischte oder reine Proben. Darüber hinaus werden gängige Methoden zur Identifizierung von mikrobiellen Isolaten sowie Verfahren zur genetischen Manipulation von Bakterien gezeigt.

See how calcium chloride makes E. coli competent for DNA uptake, then use heat shock and ampicillin selection to identify transformants.

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli | JoVE K12

Natalia Martin

Andrew J. Van Alst

Rhiannon M. LeVeque

Victor J. DiRita

Department of Microbiology and Molecular Genetics

Michigan State University

Concepts

Performing the Experiment

Results

Genetic Lingo

Overview

An organism is diploid if it inherits two variants, or alleles, of each gene, one from each parent. These two alleles constitute the genotype ...

Punnett Squares

Overview

A Punnett square displays the possible genotypes offspring can inherit from two parental genotypes. If a trait&#x2019;s inheritance pattern ...

Monohybrid Crosses

Overview

In the 1850s and 1860s, Gregor Mendel investigated inheritance by performing monohybrid crosses in pea plants. He crossed two plants that were ...

Dihybrid Crosses

Overview

To determine whether traits are inherited together or separately, Gregor Mendel crossed pea plants that differed in two traits. These parental ...

Law of Segregation

When crossing pea plants, Mendel noticed that one of the parental traits would sometimes disappear in the first generation of offspring, called the F1 ...

Law of Independent Assortment

While Mendel&#x2019;s Law of Segregation states that the two alleles for one gene are separated into different gametes, a different question of how ...

Test Cross

Alleles are different forms of the same gene. Humans and other diploid organisms inherit two alleles of every gene, one from each parent.

An allele is ...

Pedigree Analysis

Overview

A pedigree is a diagram displaying a family&#x2019;s history of a trait. Analyzing pedigrees can reveal (1) whether a trait is dominant or ...

Use Mendel's laws of segregation and independent assortment to analyze patterns of inheritance.

SC.912.L.16.1

Trihybrid Crosses

Trihybrid Crosses
Some of Mendel&#8217;s crosses examined three pairs of contrasting characteristics. Such a cross is called a trihybrid cross. A ...

Chi-square Analysis

The chi-square test is a statistical hypothesis test. It is used to check whether there is a significant difference between an expected value and an ...

Multiple Allele Traits

Incomplete Dominance

Gregor Mendel&#39;s work (1822 - 1884) was primarily focused on pea plants. Through his initial experiments, he determined that every gene in a diploid ...

Lethal Alleles

Agouti: A Lethal Allele
Lucien Cu&#233;not discovered lethal alleles in 1905 while studying the inheritance of coat color in mice. The agouti gene is ...

Polygenic Traits

background-and-environment-affect-phenotype

Background and Environment Affect Phenotype

Although the genetic makeup of an organism plays a major role in determining the phenotype, there are also several environmental factors, such as ...

Discuss observed inheritance patterns caused by various modes of inheritance, including dominant, recessive, codominant, sex-linked, polygenic, and multiple alleles.

SC.912.L.16.2

Base-pairing and DNA Repair

The DNA Replication Fork

Lagging Strand Synthesis

The Replisome

Proofreading

Synthesis of new DNA molecules is carried out by the enzyme DNA polymerase, which adds nucleotides on the daughter strand complementary to the template ...

Replication in Prokaryotes

DNA replication has three main steps: initiation, elongation, and termination. Replication in prokaryotes begins when initiator proteins bind to the ...

Replication in Eukaryotes

In eukaryotic cells, DNA replication is highly conserved and tightly regulated. Multiple linear chromosomes must be duplicated with high fidelity before ...

Describe the basic process of DNA replication and how it relates to the transmission and conservation of the genetic information.

SC.912.L.16.3

The DNA Helix

Deoxyribonucleic acid, or DNA, is the genetic material responsible for passing traits from generation to generation in all organisms and most viruses. DNA ...

Mutations

Mutations are changes in the sequence of DNA. These changes can occur spontaneously or they can be induced by exposure to environmental factors. Mutations ...

Mutation, Gene Flow, and Genetic Drift

In a population that is not at Hardy-Weinberg equilibrium, the frequency of alleles changes over time. Therefore, any deviations from the five conditions ...

Explain how mutations in the DNA sequence may or may not result in phenotypic change. Explain how mutations in gametes may result in phenotypic changes in offspring.

SC.912.L.16.4

What is Gene Expression?

A gene is a stretch of DNA that serves as the blueprint for functional RNAs and proteins. Since DNA is comprised&#160; of nucleotides and proteins are ...

RNA Structure

The basic structure of RNA consists of a string of ribonucleotides attached by phosphodiester bonds. Although most RNA is single-stranded, it can form ...

Types of RNA

Three main types of RNA are involved in protein synthesis: messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), and ribosomal RNA (rRNA). These RNAs perform diverse ...

Transcription

Transcription is the synthesis of RNA from a DNA sequence by RNA polymerase. It is the first step in producing a protein from a gene sequence. ...

Bacterial RNA Polymerase

Eukaryotic RNA Polymerases

General Transcription Factors

Tissue-specific transcription factors contribute to diverse cellular functions in mammals. For example, the gene for beta globin, a major component of ...

RNA Polymerase II Accessory Proteins

Transcription Elongation Factors

pre-mrna-processing-modification-of-pre-mrna-ends

Pre-mRNA Processing: Modification of pre-mRNA Ends

In eukaryotic cells, transcripts made by RNA polymerase are modified and processed before exiting the nucleus. Unprocessed RNA is called precursor mRNA or ...

Pre-mRNA Processing: RNA Splicing

Transfer RNA Synthesis

Ribosomal RNA Synthesis

The Nucleolus

Additional Subnuclear Structures

Translation

Translation is the process of synthesizing proteins from the genetic information carried by messenger RNA (mRNA). Following transcription, it constitutes ...

Ribosomes

Ribosomes translate genetic information encoded by messenger RNA (mRNA) into proteins. Both prokaryotic and eukaryotic cells have ribosomes. Cells that ...

tRNA Activation

Initiation of Translation

Termination of Translation

Improving Translational Accuracy

Nonsense-mediated mRNA Decay

Molecular Chaperones and Protein Folding

The Proteasome

Regulated Protein Degradation

Proteins: From Genes to Degradation

Explain the basic processes of transcription and translation, and how they result in the expression of genes.

SC.912.L.16.5

Chromatin Structure and RNA Splicing

Alternative RNA Splicing

Nuclear Export of mRNA

Discuss the mechanisms for regulation of gene expression in prokaryotes and eukaryotes at transcription and translation level.

SC.912.L.16.6

Molecular Cloning

Molecular cloning is a set of methods, which are used to insert recombinant DNA into a vector - a carrier of DNA molecules that will replicate recombinant ...

An Overview of Genetic Engineering

Genetic engineering &#8211; the process of purposefully altering an organism&#8217;s DNA &#8211; has been used to create powerful research tools and model ...

Recombineering and Gene Targeting

One of the most widely used tools in modern biology is molecular cloning with restriction enzymes, which create compatible ends between DNA fragments that ...

bacterial-transformation-the-heat-shock-method

Bacterial Transformation: The Heat Shock Method

Transformation is the process that occurs when a cell ingests foreign DNA from its surroundings. Transformation can occur in nature in certain types of ...

Bacterial Transformation: Electroporation

The term &#x201C;transformation&#x201D; refers cellular ingestion of foreign DNA.  In nature, transformation can occur in certain types of bacteria.  In ...

An Introduction to Transfection

Transfection is the process of inserting genetic material, such as DNA and double stranded RNA, into mammalian cells. The insertion of DNA into a cell ...

Conjugation: A Method to Transfer Ampicillin Resistance from Donor to Recipient E. coli

Source: Alexander S. Gold1, Tonya M. Colpitts1
1 Department of Microbiology, Boston University School of Medicine, National Emerging Infections Diseases ...

Phage Transduction: A Method to Transfer Ampicillin Resistance from Donor to Recipient E. coli

CRISPR

Bacterial Transformation

Background

In early 20th century, pneumonia was accountable for a large portion of infectious disease deaths1. In order to develop an effective vaccine ...

Bacterial Transformation
ExpandFirst, ensure that each student or student group has a filled ice bucket.
Then, set up a tube rack for each work station.
...

Bacterial Transformation
ExpandIMPORTANT: In addition to wearing the appropriate personal protective equipment, be sure to take care to keep your face ...

Describe how viruses and bacteria transfer genetic material between cells and the role of this process in biotechnology.

A. DNA stores and transmits genetic information. Genes are sets of instructions encoded in the structure of DNA.

B. Genetic information is passed from generation to generation by DNA in all organisms and accounts for similarities in related individuals.

C. Manipulation of DNA in organisms has led to commercial production of biological molecules on a large scale and genetically modified organisms.

D. Reproduction is characteristic of living things and is essential for the survival of species.

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

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