UV/VIS-Spektroskopie von Farben

Absorbance

When light interacts with a substance, a portion of the light is absorbed while the rest is either reflected or transmitted through it. Substances that we perceive as having a color reflect light in the visible range. The color of the substance that we are able to see depends on which wavelength of light is reflected. A substance that we perceive as blue reflects light in the blue range (430 – 480 nm) of the visible spectrum. According to the color wheel, the same substance absorbs light that is complementary to the reflected light. So, the blue substance absorbs light in the orange region (590 – 630 nm) of the visible spectrum. Not all compounds absorb in the visible region, and as a result, they appear as colorless to the human eye.

Light is defined by its energy, E, and its wavelength, λ. Here, h is Planck's constant, and c is the speed of light.

The wavelength of light is inversely proportional to its energy. So, higher energy light has a shorter wavelength.

Dyes

Different colored dyes vary in the wavelength of light that they absorb. Most dyes are conjugated compounds with alternating double and single bonds and typically absorb light in the visible region.

The conjugated part of the dye molecule can be very short, meaning that there is a low degree of conjugation and few alternating double and single bonds, or long, meaning that there is a high degree of conjugation with many alternating double and single bonds. These alternating double bonds do not necessarily only have to be between two carbons. These conjugated bonds can include the carbonyl groups and the double bonds between carbon and oxygen. The degree of conjugation determines the wavelength of light the compound absorbs. For example, compounds with a high degree of conjugation absorb a longer wavelength than compounds with a lower degree of conjugation.

Based on molecular orbital theory, delocalized electrons occupy molecular orbitals. The highest occupied molecular orbital, or HOMO, is the highest energy orbital with an electron. The lowest unoccupied molecular orbital, or LUMO, is the lowest energy orbital with no electron. Molecules with little or no conjugation typically have a large energy gap between the HOMO and LUMO. However, conjugated molecules have a smaller energy gap between the HOMO and LUMO.

To excite an electron from a lower energy level to a higher energy level, or from the HOMO to LUMO, the molecule must absorb light with energy equal to the energy gap between the two orbitals. For this reason, molecules with a large energy gap require higher energy light, such as UV light, to excite an electron. Dyes, however, have a smaller energy gap and require lower energy light, such as visible light, to excite an electron.

For this reason, molecules with a large energy gap require higher energy light, such as UV light, to excite an electron. Dyes, however, have a smaller energy gap and require lower energy light, such as visible light, to excite an electron.

Recall that the energy of light is inversely proportional to the wavelength. So, higher energy light has shorter wavelengths than lower energy light that has longer wavelengths.

Spectrophotometer

Experimentally, light absorbance is measured using a UV-Visible (UV-Vis) spectrophotometer. This instrument utilizes a light source that is transformed by a monochromator into specific wavelengths of light that will pass through a sample and into a detector at the other end. The samples must be in a liquid, so a solvent is required if the organic compound is a solid. This solution is held in a sample holder known as a cuvette. Depending on the sample, the cuvette may be made of quartz crystal, glass, or plastic, and has a particular pathlength. This pathlength is the distance the light must travel through the sample. Since the solvent will also absorb light, a sample blank of the solvent alone is required. Therefore, when the instrument captures the absorbance spectrum of the sample compound, it can subtract the background spectrum of the solvent to display absorbance caused by only the sample. Transmittance, T, is the fraction of the original light that passes through the sample.

Here, P₀ is the irradiance, or the energy per second per unit area, of the light beam prior to striking the sample. P is the irradiance of the light beam striking the detector. P is typically lower than P₀, as some of the light is absorbed by the sample.

Absorbance, A, is defined as the negative log of transmittance.

Absorbance has a value range between 0 (no absorption) and 2 (99% absorption). When no light is absorbed, P₀ is equal to P, and the transmittance is equal to one. Thus, absorbance is zero. If 90% of the light is absorbed, then 10% is transmitted and T is equal to 0.1. This results in an absorbance equal to 1. If 99% of the light is absorbed, then 1% is transmitted (T= 0.01), and absorbance is equal to 2.

The spectrum obtained is a plot of the absorbance versus the wavelength. For a UV-Vis spectrophotometer, this range is between 200 and 800 nm.

Beer-Lambert Law

Transmittance and absorbance of a particular compound is related to the concentration of the compound in solution. This relationship is described by the Beer-Lambert law.

The absorbance of the sample is equal to the product of the concentration of the compound, the path length, and the molar attenuation coefficient. This coefficient is unique to each compound and will vary by wavelength. However, if the wavelength is held constant, the molar attenuation coefficient will be the same irrespective of changes in concentration. The wavelength that corresponds to the highest absorbance of the sample, known as λ_max, also will have the largest molar attenuation coefficient.

References

1. Silberberg, M.S. (2012). Chemistry: The Molecular Nature of Matter and Change. Boston, MA: McGraw Hill.
2. Harris, D.C. (2015). Quantitative Chemical Analysis. New York, NY: W.H. Freeman and Company.

Wenn Licht auf eine Substanz trifft, wird ein Teil von ihr absorbiert, während der Rest entweder reflektiert oder durch sie hindurch übertragen wird. Die Farbe der Substanz, wie wir sie wahrnehmen, hängt davon ab, welche Wellenlängen sie am ehesten reflektiert. Zum Beispiel enthält ein Stück Stoff, das wir als blau sehen, einen Farbstoff, der blaues Licht stark reflektiert und orangefarbenes und rotes Licht stark absorbiert.

Farbstoffe sind in der Regel konjugierte Verbindungen, was bedeutet, dass sie abwechselnd Doppel- und Einfachbindungen aufweisen. Elektronen können sich innerhalb des konjugierten Systems frei bewegen. Verschiedenfarbige Farbstoffe müssen in den Wellenlängen des Lichts, das sie absorbieren, variieren. Wenn wir uns ein paar Beispiele ansehen, sehen wir, dass die absorbierte Wellenlänge mit der Menge der Konjugation zunimmt.

Wie hängt also die Wellenlänge mit dem Grad der Konjugation zusammen? Betrachten wir das molekulare Energieniveau. Wir können uns delokalisierte Elektronen als Molekülorbitale oder MOs vorstellen. Ein Molekül absorbiert Licht mit genau der Energie, die benötigt wird, um ein Elektron zu einem Molekülorbital mit höherer Energie anzuregen. Der wahrscheinlichste Übergang ist vom am höchsten besetzten Molekülorbital, dem sogenannten HOMO, zum niedrigsten unbesetzten Molekülorbital (LUMO). Wir gehen also davon aus, dass die am stärksten absorbierte Wellenlänge mit der Energielücke zwischen HOMO und LUMO übereinstimmt.

Moleküle mit wenig oder keiner Konjugation haben typischerweise eine große HOMO-LUMO-Lücke. Sie absorbieren UV-Licht und reflektieren das gesamte sichtbare Licht, so dass sie weiß oder farblos erscheinen. Konjugierte Bindungen stabilisieren Moleküle, indem sie ihr Energieniveau senken, insbesondere bei hohen Energien. Je höher der Konjugationsgrad ist, desto kleiner ist die HOMO-LUMO-Lücke und desto größer ist die absorbierte Wellenlänge. Auch Metalle und Substitutionen beeinflussen den Spalt.

Schauen wir uns ein Beispiel an. Retinol hat ein kleines konjugiertes System, während Chlorophyll a ein großes System mit Stickstoff und Magnesium hat. Retinol absorbiert bei 325 nm, während Chlorophyll a sowohl bei 430 als auch bei 662 nm absorbiert wird. Erwartungsgemäß ist die Energielücke von Retinol größer.

Wir können die Absorption mit einem UV- und sichtbaren Licht oder UV-Vis-Spektralphotometer untersuchen. Ein Spektralphotometer besteht aus einer Lichtquelle, einer Möglichkeit zur Steuerung der Wellenlängen, die die Probe erhält, und einem Lichtdetektor. Die Probe ist in der Regel eine transparente Lösung. Die Extinktion kann bei einer bestimmten Wellenlänge oder über einen Wellenlängenbereich gemessen werden, da Verbindungen oft bei mehr als einer Wellenlänge absorbieren. Darüber hinaus sehen wir für jeden Übergang einen Bereich von Wellenlängen, da sich die Moleküle in unterschiedlichen Orientierungen und Schwingungszuständen befinden.

Während der Messung wird das Licht entweder absorbiert, durchgelassen, ohne mit Molekülen in Berührung zu kommen, oder es prallt von einem Lösungsmittel oder Verbindungsmolekül ab. Wir ignorieren die kleine Menge an Licht, die nach hinten reflektiert wird. Manchmal prallt stattdessen Licht, das von einem Molekül absorbiert werden könnte, von ihm ab. Wir beschreiben, wie gut eine Substanz eine bestimmte Wellenlänge mit einem einzigartigen molaren Dämpfungskoeffizienten überträgt. Während sich die Absorption mit der Konzentration ändert, ändert sich der molare Dämpfungskoeffizient nicht.

Nach der Messung vergleicht das Spektralphotometer das empfangene und das ursprüngliche Licht in einem Verhältnis, das als Durchlässigkeit bezeichnet wird. Die Absorption ist der Logarithmus der Durchlässigkeit zur negativen Basis 10. Wenn das Spektralphotometer die Absorption des Lösungsmittels hat, subtrahiert es sie, um nur die Verbindung anzuzeigen. Die Ergebnisse werden in der Regel als Absorption über Wellenlänge angezeigt. Die Wellenlänge, bei der die Verbindung am meisten absorbiert, wird als Lambda max bezeichnet. Wenn wir den molaren Dämpfungskoeffizienten für jede Wellenlänge berechnen würden, wäre er bei maximal Lambda am höchsten.

Der molare Dämpfungskoeffizient, die Absorption, die Probenkonzentration und die Weglänge, d. h. die Entfernung, die das Licht durch die Probe zurücklegt, werden durch das Beer-Lambert-Gesetz in Beziehung gesetzt. Wenn wir drei beliebige Variablen kennen, können wir die vierte berechnen.

In diesem Labor analysieren Sie die Absorptionseigenschaften von Fluorescein, Beta-Carotin und Indigofarbstoff mit einem UV-Vis-Spektralphotometer. Anschließend verwenden Sie das Beer-Lambert-Gesetz, um eine β-Carotin-Kalibrierungskurve zu erstellen und dann die Konzentration der β-Carotin-Lösung zu bestimmen.