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Quelle: Lara Al Hariri und Ahmed Basabrain an der University of Massachusetts Amherst, MA, USA
Im ersten Teil des Labors verwenden Sie die Absorptionsspektroskopie des ultravioletten und sichtbaren Lichts oder die UV-Vis-Absorptionsspektroskopie, um die Absorptionseigenschaften von Fluorescein, β-Carotin und Indigofarbstoff zu analysieren. Um eine UV-Vis-Spektroskopie durchzuführen, platzieren Sie eine Lösung zwischen einer Lichtquelle und einem Photodetektor. Die Moleküle absorbieren Licht bei Wellenlängen, die den Energien entsprechen, die benötigt werden, um ihre Elektronen anzuregen und den Rest zu streuen oder zu übertragen.
Ein Absorptionsspektrum stellt die Variation der Anzahl der Photonen jeder Wellenlänge dar, die den Detektor erreichen. Eine höhere Absorption entspricht weniger detektierten Photonen dieser Wellenlänge. Sie nehmen zuerst ein Spektrum des reinen Lösungsmittels, das das Gerät vom Spektrum der Farbstofflösung subtrahiert, um Ihnen nur die Absorptionsdaten des Farbstoffs zu zeigen. Diese Referenz wird als Lösungsmittel-Blindwert bezeichnet.
| Absorptionsbereich (nm) | λmax (nm) | |
| Fluorescein | ||
| β-Carotin | ||
| Indigo |
In der zweiten Hälfte des Labors verwenden Sie die UV-Vis-Spektroskopie, um die Absorptionsintensität und -konzentration für β-Carotin in Beziehung zu setzen, indem Sie die Absorptionen von 5 β-Carotin-Lösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen messen. Auf diese Weise können Sie eine Kalibrierungskurve der Absorption gegenüber der β-Carotin-Konzentration erstellen und die Gleichung ableiten, die diese Beziehung beschreibt.
| Test | Konzentration (μM) | Extinktion bei λmax (450 nm) |
| 1 | 1.9 | |
| 2 | 3.7 | |
| 3 | 7.5 | |
| 4 | 11 | |
| 5 | 15 |
Schauen Sie sich zunächst die Spektren der drei Farbstoffe an. Fluorescein in Wasser absorbiert blaues und violettes Licht, wobei die maximale Absorption bei 490 nm liegt. Es absorbiert kein rotes Licht, sondern nur etwas gelbes und grünes Licht. In Übereinstimmung damit ist festes Fluorescein rot und Fluoreszeinlösungen normalerweise gelb bis grün.
β-Carotin absorbiert auch blaues und violettes Licht. Die maximale Absorption von β-Carotin in Hexan beträgt 450 nm, und Sie werden einen weiteren großen Peak bei 478 nm sehen. Die starke Absorption von violettem Licht ist ein Grund, warum β-Carotin orange erscheint.
Indigo in DMF absorbiert UV-Licht sowie rotes, orangefarbenes und gelbes Licht, mit einem deutlichen Peak bei 611 nm. So reflektiert der Farbstoff Indigo hauptsächlich blaues und violettes Licht, was ihm seine charakteristische Farbe verleiht.
Im ersten Teil des Labors verwenden Sie die Absorptionsspektroskopie für ultraviolettes und sichtbares Licht oder UV-Vis-Absorptionsspektroskopie, um die Absorptionseigenschaften von Fluorescein, Carotin und Indigofarbstoff zu analysieren. Um eine UV-Vis-Spektroskopie durchzuführen, platzieren Sie eine Lösung zwischen einer Lichtquelle und einem Photodetektor. Die Moleküle absorbieren Licht bei Wellenlängen, die den Energien entsprechen, die benötigt werden, um ihre Elektronen anzuregen, und streuen oder übertragen den Rest.
Ein Absorptionsspektrum stellt die Variation in der Anzahl der Photonen jeder Wellenlänge dar, die den Detektor erreichen. Eine höhere Absorption entspricht weniger detektierten Photonen dieser Wellenlänge. Sie nehmen zuerst ein Spektrum des reinen Lösungsmittels, das das Gerät vom Spektrum der Farbstofflösung subtrahiert, um Ihnen nur die Absorptionsdaten des Farbstoffs zu zeigen.
Diese Referenz wird als Lösungsmittel-Blindwert bezeichnet. Bevor Sie beginnen, ziehen Sie einen Laborkittel, eine Schutzbrille und Handschuhe an. Die Carotin- und Indigolösungen verwenden Hexan bzw. Dimethylformamid, sodass Sie mit den Farbstoffen in einem Abzug arbeiten.
DMF und Hexan zersetzen dünne Nitrilhandschuhe, also wechsle deine Handschuhe, wenn du Lösungsmittel auf sie bekommst. Besorgen Sie sich nun eine saubere Quarzküvette. Küvetten haben in der Regel zwei transparente Seiten und zwei strukturierte oder undurchsichtige Seiten.
Halten Sie die Küvette immer an den strukturierten Seiten, um die transparenten Seiten sauber zu halten. Zuerst analysieren Sie eine Lösung von Fluorescein in Wasser. Um Ihr Lösungsmittel blank zu machen, füllen Sie Ihre Küvette zu etwa 3/4 mit entionisiertem Wasser.
Reinigen Sie nun die durchsichtigen Seiten der Küvette mit einem Labortuch. Überprüfen Sie die Küvette auf Luftblasen und klopfen Sie vorsichtig auf die Küvette, um sie zu lösen. Bringen Sie dann die Küvette zum Spektrometer.
Öffnen Sie die Probenkammer des Spektrometers und reinigen Sie Ihre Küvette ein letztes Mal. Flecken und Staub können Licht absorbieren oder reflektieren, was zu Fehlern in den Daten führt. Setzen Sie nun die Küvette so in den Probenhalter ein, dass die transparenten Seiten auf einer Linie mit der Lichtquelle liegen.
Schließen Sie die Tür der Probenkammer vollständig. Befolgen Sie die Anweisungen Ihrer Spektrometer-Software, um einen Scan der Absorption von 200 bis 800 Nanometern einzurichten und Ihre Küvette als Lösungsmittelrohling zu scannen. Wenn der Scan abgeschlossen ist, leeren Sie die Küvette und verwenden Sie Druckluft, um große Wassertropfen zu entfernen.
Bringen Sie es dann zur gemeinsamen Haube und füllen Sie die Küvette mit einer sauberen Pasteurpipette zu 3/4 mit der mitgelieferten 3-mikromolaren Fluoresceinlösung. Überprüfen Sie die Küvette auf Luftblasen und entfernen Sie diese bei Bedarf, bevor Sie die Küvette zum Spektrometer bringen. Denken Sie daran, die transparenten Seiten ein letztes Mal zu reinigen, bevor Sie die Küvette in die Probenkammer legen.
Scannen Sie dann die Küvette als Ihre Probe. Wenn der Scan abgeschlossen ist, identifizieren Sie die Wellenlängen, die Fluorescein absorbiert hat. Die Wellenlänge mit der höchsten Absorption wird als lambda max bezeichnet.
Zeichnen Sie die Wellenlängen der Absorptionspeaks und den gesamten Absorptionsbereich in Ihrem Labornotizbuch auf und speichern Sie die Daten. Entleeren Sie nun Ihre Küvette in den wässrigen Abfall und spülen Sie sie mit Wasser aus, um Spuren von Fluorescein zu entfernen. Als nächstes analysieren Sie Carotin, daher benötigen Sie einen Hexan-Lösungsmittel-Rohling.
Spülen Sie die Küvette einige Male mit Hexan aus, um Wasserreste zu entfernen, bevor Sie sie zu 3/4 mit reinem Hexan füllen. Entfernen Sie die Luftblasen, reinigen Sie die Seiten der Küvette und legen Sie sie in das Spektrometer. Stellen Sie sicher, dass der Scan auf eine Absorption von 200 bis 800 Nanometern eingestellt ist, und scannen Sie dann die Küvette als Lösungsmittelrohling.
Wenn der Scan abgeschlossen ist, leeren Sie die Küvette in den Bioabfall und trocknen Sie sie mit Druckluft. Füllen Sie die Küvette mit einer sauberen Pipette zu 3/4 mit der mitgelieferten 3-mikromolaren Carotinlösung und kehren Sie zum Spektrometer zurück. Reinigen Sie die transparenten Seiten der Küvette, legen Sie sie in das Spektrometer und scannen Sie sie als Probe.
Schreiben Sie die Wellenlängen der Peaks in Ihr Labornotizbuch und speichern Sie die Daten. Jetzt ist es an der Zeit, den Indigofarbstoff zu analysieren. Die Indigolösung befindet sich in DMF, entleeren Sie also Ihre Küvette in den Biomüll und spülen Sie das übrig gebliebene Carotin und Hexan mit reinem DMF aus.
Füllen Sie die Küvette zu 3/4 mit reinem DMF, legen Sie sie in das Spektrometer und stellen Sie sicher, dass die Scaneinstellungen die gleichen sind wie zuvor. Führen Sie den Lösungsmittel-Blankoscan durch, entleeren Sie dann die Küvette in den organischen Abfall und trocknen Sie sie mit Druckluft. Füllen Sie die Küvette mit einer sauberen Pipette zu 3/4 mit der mitgelieferten 3-mikromolaren Indigo-Farbstofflösung und scannen Sie sie als Probe.
Notieren Sie sich die Absorptionsinformationen und speichern Sie Ihre Daten. Zum Schluss entleeren Sie Ihre Küvette in den Bioabfall und spülen Sie sie mit Aceton aus. In der zweiten Hälfte des Labors verwenden Sie die UV-Vis-Spektroskopie, um die Absorptionsintensität und -konzentration für Carotin in Beziehung zu setzen, indem Sie die Absorption von fünf Carotinlösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen messen.
Auf diese Weise können Sie eine Kalibrierungskurve der Absorption im Vergleich zur Carotinkonzentration erstellen und die Gleichung ableiten, die diese Beziehung beschreibt. Erstellen Sie zunächst in Ihrem Labornotizbuch eine Tabelle mit Säulen für die Carotinkonzentration und -absorption bei 450 Nanometern. Besorge dir dann eine saubere Küvette und fülle sie zu 3/4 mit Hexan als Lösungsmittelrohling.
Entfernen Sie alle Luftblasen, reinigen Sie die durchsichtigen Seiten der Küvette und legen Sie sie in das Spektrometer. Richten Sie einen Absorptionsscan von 200 bis 800 Nanometern ein und scannen Sie die Küvette als Lösungsmittelrohling. Wenn der Scan abgeschlossen ist, leeren Sie die Küvette in den Bioabfall und trocknen Sie sie mit Druckluft.
Füllen Sie dann die Küvette mit einer sauberen Pipette zu 3/4 mit der 1,9 mikromolaren Carotinlösung, der Lösung mit der niedrigsten Konzentration. Reinigen Sie die Seiten der Küvette, setzen Sie sie in das Spektrometer ein und scannen Sie sie als Probe. Wenn der Scan abgeschlossen ist, zeigen Sie die Absorptionsintensität des Peaks bei 450 Nanometern an.
Notieren Sie dies in Ihrem Labornotizbuch als Absorption für die 1,9 mikromolare Lösung. Entleeren Sie nun die Küvette in den Bioabfall, spülen Sie sie mit Hexan aus und trocknen Sie sie mit Druckluft ab. Füllen Sie die Küvette mit einer sauberen Pipette zu 3/4 mit der 3,7 mikromolaren Carotinlösung.
Reinigen Sie die Seiten der Küvette, setzen Sie sie in das Spektrometer ein und scannen Sie sie als weitere Probe. Wenn der Scan abgeschlossen ist, notieren Sie die Absorption des Peaks bei 450 Nanometern. Wiederholen Sie dies für die restlichen Lösungen, wobei Sie von der niedrigsten zur höchsten Konzentration arbeiten.
Speichern Sie Ihre Daten, wenn Sie fertig sind. Zum Schluss entleeren Sie die Küvette in den Bioabfall und reinigen sie mit Aceton. Schauen wir uns zunächst die Spektren der drei Farbstoffe an.
Fluorescein in Wasser absorbiert blaues und violettes Licht, wobei die maximale Absorption bei 490 Nanometern liegt. Es absorbiert kein rotes Licht und absorbiert nur etwas gelbes und grünes Licht. In Übereinstimmung damit ist festes Fluorescein rot und Fluoreszeinlösungen normalerweise gelb bis grün.
Carotin absorbiert auch blaues und violettes Licht. Die maximale Absorption von Carotin in Hexan beträgt 450 Nanometer und Sie werden einen weiteren großen Peak bei 478 Nanometern sehen. Die starke Absorption von violettem Licht ist ein Grund, warum Carotin orange erscheint.
Indigo in DMF absorbiert UV-Licht sowie rotes, orangefarbenes und gelbes Licht, mit einem deutlichen Peak bei 611 Nanometern. So reflektiert der Farbstoff Indigo hauptsächlich blaues und violettes Licht, was ihm seine charakteristische Farbe verleiht. Lassen Sie uns nun die Kalibrierungskurve für die Carotinkonzentration erstellen.
Plotten Sie die Carotin-Absorptionswerte bei 450 Nanometern aus der zweiten Hälfte des Labors gegen die Konzentrationen der Lösungen. Wenden Sie dann eine Trendlinie an, und suchen Sie die lineare Gleichung, die zu den Daten passt. Nach dem Beer-Lambert-Gesetz ist in dieser Gleichung y die Absorption, x die Konzentration und die Steigung das Produkt aus dem relevanten molaren Dämpfungskoeffizienten und der Weglänge.
Um Ihre Gleichung zu überprüfen, ordnen Sie sie so an, dass sie nach Konzentration auflöst, und geben Sie die Carotin-Absorption bei 450 Nanometern aus dem ersten Teil des Labors ein. Die berechnete Konzentration sollte nahe bei 3 Mikromol pro Liter liegen.
