4.4:

4.4: Die Gleichgewichts-Bindungskonstante und die Bindungsstärke

The Equilibrium Binding Constant and Binding Strength

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Molecular Biology

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JoVE Core Molecular Biology

The Equilibrium Binding Constant and Binding Strength

4.3: Conserved Binding Sites

4.5: Cofactors and Coenzymes

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02:18 min

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November 23, 2020

Overview

The equilibrium binding constant (K_b) quantifies the strength of a protein-ligand interaction. K_bcan be calculated as follows when the reaction is at equilibrium:

where P and L are the unbound protein and ligand, respectively, and PL is the protein-ligand complex.

As the amount of bound ligand is also related to the rate of ligand binding, experiments can also determine K_b by examining the rates of protein-ligand association (k_on) and dissociation (k_off) using the following ratio:

Thus, two categories of binding assays are used to determine the equilibrium binding constant – those that measure equilibrium concentrations and those that measure a reaction’s kinetics. In case, the reaction must be at equilibrium at the time of measurement.

The method of determining the equilibrium concentrations depends on the desired sensitivity and ease of signal detection. For these reasons, spectroscopic assays are most widely used. In these experiments, the reaction produces an absorbance change of a reactant or a product at a given wavelength, detectable by a UV-Vis spectrophotometer. Alternatively, the reactant or product can be tagged with a fluorescent probe or may contain an intrinsic fluorophore. Then, the reaction progress can be measured from the change in fluorescence. These assays are performed by varying one reactant’s concentrations while the rest of the experiment is held constant. The results can then be graphed and analyzed with various curve fitting methods.

Interactions between proteins and ligands are also studied using a variety of biochemical and spectroscopic techniques. Structural analysis, using X-ray crystallography and NMR spectroscopy, aids in predicting protein-ligand interactions through molecular simulations. Theoretical and computational approaches, such as protein-ligand docking studies, are used extensively to characterize the position and interactions of small molecule ligands, including drug candidates. Computer-aided drug design is a fast and low-cost alternative to accelerate the pace of conventional trial and error drug testing.

Transcript

In der Zelle kollidieren Proteine zufällig mit anderen Molekülen, wie z. B. anderen Proteinen, Nukleinsäuren und niedermolekularen Liganden.

Wenn die Bindung unspezifisch ist, führen einige nicht-kovalente Wechselwirkungen zwischen den Molekülen zu einer kurzen Assoziation.

Bindet ein bestimmter Ligand an das Protein, bildet er ausgedehnte nicht-kovalente Wechselwirkungen entlang komplementärer Oberflächen. Solche Komplexe sind stabil und bleiben lange Zeit gebunden, bevor sie sich dissoziieren.

Die Stärke einer Bindungswechselwirkung wird in Bezug auf ihre Gleichgewichtskonstante K_b angegeben, die auch als Bindungs- oder Assoziationskonstante bezeichnet wird.

K_b kann aus dem Verhältnis der Konzentration des Protein-Liganden-Komplexes zu den Konzentrationen des ungebundenen Proteins und des Liganden im Gleichgewicht berechnet werden.

Aufgrund seiner Beziehung zur Änderung der freien Energie aufgrund der Bindung bedeutet ein großes K_b eine starke Abnahme von Delta G, was auf eine starke Affinität zwischen Protein und Liganden hinweist.

Für die Protein-Liganden-Bindung sind zwei konkurrierende Prozesse wichtig: die Assoziation eines Proteins und eines Liganden zu einem Komplex und die Dissoziation des Komplexes in die Reaktanten.

Die Assoziationskonstante k_on ist ein Maß für die Anzahl der Bindungsereignisse pro Sekunde zwischen einem Protein und seinem Liganden; sie kann verwendet werden, um die Bindungsrate des Liganden an das Protein bei einer bestimmten Konzentration zu berechnen.

Umgekehrt ist k_off ein Maß für die Anzahl der Dissoziationsereignisse; es kann verwendet werden, um zu berechnen, wie schnell der Komplex auseinanderfällt.

Wenn die Assoziationsrate der Dissoziationsrate entspricht, wird ein Gleichgewicht erreicht, bei dem die Nettokonzentrationen von Produkten und Reaktanten konstant bleiben.

Somit ist im Gleichgewicht k_on mal das Produkt aus den Gleichgewichtskonzentrationen des Proteins und des Liganden gleich k_off mal der Gleichgewichtskonzentration des Protein-Liganden-Komplexes.

Die Neuanordnung dieses Ausdrucks zeigt auch, dass das Verhältnis von k_on zu k_off gleich K_b im Gleichgewicht ist.

Key Terms and definitions

Learning Objectives

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Tags

Gleichgewichtsbindungskonstante Bindungsstärke unspezifische Bindung spezifische Ligandenbindung nicht-kovalente Wechselwirkungen stabile Komplexe Dissoziation Konzentrationsverhältnis Affinität Assoziationskonstante Kon Ligandenbindungsrate Dissoziationskonstante Koff