4.7
Komplementäre DNA
Fast jede Zelle im Körper hat die gleiche DNA, aber verschiedene Zelltypen wie Neuronen und Muskelzellen exprimieren unterschiedliche Gene, da in jeder Zelle nur bestimmte Gene in Messenger-RNA oder mRNA transkribiert werden. Im Labor können mRNAs als Matrize zur Synthese komplementärer DNA (cDNA) zur Untersuchung der Genexpression verwendet werden. Eine übliche Methode besteht darin, RNA aus Zellen zu extrahieren und dann die mRNA aus anderen RNA-Typen wie ribosomaler RNA oder Transfer-RNA zu isolieren, indem die Probe über eine Kügelchensäule mit anhaftenden Thyminnukleotid-Abschnitten geführt wird.
Diese binden an den Poly(A)-Schwanz, eine Kette von Adeninnukleotiden, die spezifisch an den 3 primären Enden der eukaryotischen mRNA vorhanden sind. Die anderen RNA-Typen binden nicht und werden weggespült. Nachdem die mRNA isoliert wurde, wird ein Poly(T)-Primer an den Poly(A)-Schwanz gebunden, was einen Ausgangspunkt für reverse Transkriptaseenzyme darstellt, um einen Einzelstrang in cDNA aus der mRNA zu transkribieren.
Chemikalien wie RNase-Enzyme werden dann zugesetzt, um die RNA abzubauen. DNA-Polymeraseenzyme werden dann verwendet, um einen zur cDNA komplementären Strang zu synthetisieren, was zu doppelsträngiger cDNA führt, die in einen bakteriellen oder viralen Vektor inseriert und in der molekularbiologischen Forschung verwendet werden kann. cDNA - bakterieller Vektor
Überblick
Nur Gene, die in Boten-RNAs (mRNA) umgesetzt werden, sind aktiv oder werden exprimiert. Wissenschaftler können daher die mRNA aus Zellen extrahieren, um die Genexpression in verschiedenen Zellen und Geweben zu untersuchen. Dabei wird transkribiert der Wissenschaftler die mRNA in komplementäre DNA (cDNA) durch die reverse Transkription. Da die mRNA keine Introns (nicht-kodierende Regionen) und andere regulatorische Sequenzen enthält, erlaubt die cDNAauch die direkte Bestimmung der Aminosäuresequenz des vom Gen kodierten Peptids. Dies ist bei der —im genomischen DANN nicht möglich.
Die cDNA-Synthese
cDNA kann durch verschiedene Methoden erzeugt werden, aber der meist verwendete Weg ist es die gesamte RNA aus den Zellen zu isolieren und dann die mRNA von den am häufigsten vorkommenden Typen, der Transfer-RNA (tRNA) oder der ribosomalen RNA (rRNA) zu trennen. Reife eukaryotische mRNA hat einen poly(A)-Schwanz. Das ist eine Reihe von Adenin-Nukleotiden, die sich an dem 3’ Ende befinden, während andere RNA-Typen diese nicht besitzen. Daher kann eine Reihe von Thymin-Nukeotiden (Oligo-dTs) an ein Substrat wie eine Säule oder magnetische Beads angehängt werden, um spezifisch mit den poly(A)-Schwänzen der mRNA ein Basenpaar zu bilden. Während die mRNA mit dem poly(A)-Schwanz gebunden wird, können die anderen RNA-Typen weggewaschen werden.
Als nächstes wird die Reverse Transkriptase, eine DNA-Polymerase-Enzym aus Retroviren, verwendet um die mRNA in cDNA umzuschreiben. Da die Reverse Transkriptase, wie die meisten DNA-Polymerasen, nur Nukleotide an das 3’ Ende hinzufügen kann, wird ein Poly(T)-Primer verwendet, der den Poly(A)-Schwanz bindet und somit als Startpunkt für die cDNA-Synthese fungiert. Der cDNA-Strang endet in einer Haarnadelschleife. Die RNA wird dann üblicherweise mit Hilfe einer Alkalibehandlung oder RNase-Enzymen abgebaut, wobei die einzelsträngige cDNA intakt bleibt.
Ein zweiter, zur cDNA komplementärer DNA-Strang wird dann durch eine DNA-Polymerase synthetisiert. Dies findet oft unter Verwendung der Haarnadelschleife des ersten cDNA-Stranges oder eines Stückes der mRNA als Primer statt.
Die resultierende doppelsträngige cDNA kann in bakterielle oder virale Vektoren eingefügt und mit den üblichen molekularbiologischen Techniken geklont werden. Eine cDNA-Bibliothek, welche alle mRNAs von bestimmten Zellen oder Geweben darstellt, kann auch für zusätzliche Forschung hergestellt werden.
Fast jede Zelle im Körper hat die gleiche DNA, aber verschiedene Zelltypen wie Neuronen und Muskelzellen exprimieren unterschiedliche Gene, da in jeder Zelle nur bestimmte Gene in Messenger-RNA oder mRNA transkribiert werden. Im Labor können mRNAs als Matrize zur Synthese komplementärer DNA (cDNA) zur Untersuchung der Genexpression verwendet werden. Eine übliche Methode besteht darin, RNA aus Zellen zu extrahieren und dann die mRNA aus anderen RNA-Typen wie ribosomaler RNA oder Transfer-RNA zu isolieren, indem die Probe über eine Kügelchensäule mit anhaftenden Thyminnukleotid-Abschnitten geführt wird.
Diese binden an den Poly(A)-Schwanz, eine Kette von Adeninnukleotiden, die spezifisch an den 3 primären Enden der eukaryotischen mRNA vorhanden sind. Die anderen RNA-Typen binden nicht und werden weggespült. Nachdem die mRNA isoliert wurde, wird ein Poly(T)-Primer an den Poly(A)-Schwanz gebunden, was einen Ausgangspunkt für reverse Transkriptaseenzyme darstellt, um einen Einzelstrang in cDNA aus der mRNA zu transkribieren.
Chemikalien wie RNase-Enzyme werden dann zugesetzt, um die RNA abzubauen. DNA-Polymeraseenzyme werden dann verwendet, um einen zur cDNA komplementären Strang zu synthetisieren, was zu doppelsträngiger cDNA führt, die in einen bakteriellen oder viralen Vektor inseriert und in der molekularbiologischen Forschung verwendet werden kann. cDNA - bakterieller Vektor
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