Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)

Die Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung oder FISH ist eine Technik, mit der die Position bestimmter Gene oder Teile von Genen auf Chromosomen in fixierten Zellen nachgewiesen werden kann.

Bei dieser Technik wird eine fluoreszenzmarkierte einzelsträngige DNA als Sonde verwendet, um Teile von Chromosomen zu binden, die eine komplementäre DNA-Sequenz enthalten, die als Ziel bezeichnet wird.

Zuerst werden die Zellen in der Interphase oder Metaphase arretiert. Die aufgefangenen Zellen werden in Pufferlösung suspendiert und auf einem sauberen Objektträger verteilt.

Anschließend werden die Ziel-DNA und die markierten Sonden mit Hitze oder Chemikalien denaturiert. In diesem Schritt wird die doppelsträngige DNA getrennt, so dass sowohl die Sonde als auch die Ziel-DNA als einzelsträngige Sequenzen zurückbleiben, die zur Basenpaarung fähig sind.

Dann werden die Sonde und die Ziel-DNA miteinander vermischt und über Nacht inkubiert. Dies ermöglicht es der Sonde, mit ihrer komplementären Sequenz auf den Chromosomen zu hybridisieren.

Sobald die Hybridisierung abgeschlossen ist, wird die überschüssige Sonde abgewaschen.

Wenn die Sonde mit einem Fluorophor markiert wurde, können die Positionen der hybridisierten DNA direkt mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden.

Ist dies nicht der Fall, muss die hybridisierte DNA vor der Visualisierung fluoreszenzmarkiert werden. Dazu muss die Sondensequenz ein modifiziertes Nukleotid enthalten, das an ein Hapten gebunden ist – ein kleines Molekül, an das das Fluorophor – wie z. B. ein fluoreszierender Antikörper – binden kann.

Eine solche direkte Visualisierung von Genen ist sehr nützlich für zellbasierte diagnostische Assays, bei denen genetische Anomalien durch Verlust..., Zugewinn oder Umlagerung von Chromosomen während der Zellteilung nachgewiesen werden können.