Echtzeit-RT-PCR

Die Echtzeit-Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion oder Echtzeit-RT-PCR kann eine RNA von Interesse quantifizieren, während die Reaktion fortschreitet.

Zu Beginn kopiert die reverse Transkriptase die RNA in komplementäre oder cDNA. RNase H verdaut die ursprüngliche RNA und hinterlässt kleine Primer, die an die cDNA gebunden sind.

Ein komplementärer Strang wird dann durch DNA-Polymerase synthetisiert.

Eine gezielte Amplifikation kann dann mittels PCR durchgeführt werden, um exponentielle Kopien bestimmter Segmente zu erstellen. Die beiden Stränge werden zu Beginn jedes Zyklus bei hohen Temperaturen getrennt. Komplementäre Oligonukleotid-Primer glühen dann an jedem cDNA-Strang und werden durch DNA-Polymerase verlängert.

Die DNA kann mit einer von zwei verschiedenen fluoreszenzbasierten Detektionsmethoden quantifiziert werden. Eine Methode verwendet Farbstoffe, die nur fluoreszieren, wenn sie an doppelsträngige DNA gebunden sind.

Der Farbstoff bindet an die DNA, wo der ursprüngliche Strang mit einem neu synthetisierten Komplementärstrang gepaart wird. Am Ende eines jeden PCR-Zyklus regt eine geeignete Wellenlänge des Lichts den gebundenen Farbstoff an.

Die andere Methode verwendet komplementäre sequenzspezifische Oligonukleotidsonden, die an ein Fluorophor und ein Quenchermolekül gebunden sind.

Die Reaktion wird kontinuierlich einer geeigneten Lichtwellenlänge ausgesetzt, und das Quenchermolekül absorbiert die Fluoreszenz des Fluorophors, wenn es sich nahe beieinander befindet. Die DNA-Polymerase löst das Fluorophor während der Verlängerung ab und verhindert so das Abschrecken.

Die sondenbasierte Methode ist spezifisch, da sie nur an die Zielsequenz angehängt wird. Im Gegensatz dazu ist die farbstoffbasierte Methode unspezifisch und bindet an alle doppelsträngige DNA.

In beiden Fällen wird die vom angeregten Fluorophor emittierte Fluoreszenz von Photodetektoren erfasst, die die empfangenen Signale in einen digitalen Ausgang umwandeln.

Der Schwellenwertzyklus oder Ct ist die Anzahl der PCR-Zyklen, für die die Fluoreszenz ein festgelegtes Niveau erreicht, das weit über der Hintergrundfluoreszenz liegt.

Der Schwellenzyklus ist umgekehrt proportional zur Menge der Ziel-RNA in der Erstprobe – je niedriger der Schwellenzyklus, desto höher die Menge der interessierenden RNA

.

Bei der absoluten Quantifizierung wird der Schwellenzyklus oder die Fluoreszenzintensität mit der einer Standardkurve verglichen, die unter Verwendung bekannter DNA-Konzentrationen erstellt wurde.

Alternativ vergleicht die relative Quantifizierung die Fluoreszenz einer Probe mit der einer Referenz. Mit dieser Methode lassen sich Veränderungen der Genexpression unter verschiedenen Bedingungen vergleichen.