Question 1

Warum wird RACE verwendet, um vollständige cDNA-Sequenzen zu erhalten?

Accepted Answer

RACE wird verwendet, weil neuartige mRNA-Transkripte oft partielle cDNAs mit unbekannten Sequenzen an den 5'- oder 3'-Enden ergeben. Diese Technik erweitert partielle cDNA-Sequenzen von einer bekannten internen Stelle zu den unbekannten Enden mittels verankerter PCR und ermöglicht es Forschern, komplette cDNA für das Transkript zu erhalten.

Question 2

Wie funktioniert die Hybrid-Primer in 3' RACE?

Accepted Answer

Die Hybrid-Primer besteht aus einer Oligo-dT-Sequenz, die an eine einzigartige Ankersequenz gebunden ist. Die Oligo-dT bindet den Poly-A-Schwanz am 3'-Ende reifer mRNAs, während der Anker einzigartige Nukleotide stromaufwärts der Poly-T-Sequenz im neu synthetisierten ersten cDNA-Strang hinzufügt.

Question 3

Welche Rolle spielen verschachtelte Primer bei der RACE-Amplifikation?

Accepted Answer

Verschachtelte Primer binden stromabwärts von Primern aus der ersten PCR-Runde und erhöhen die Spezifität und Ausbeute von vollständigen cDNAs. Da Adapterprimer nebenziel-Sequenzen amplifizieren können, reduziert ein zweiter Amplifikationszyklus mit verschachtelten Primern unspezifische Produkte und verbessert die Rückgewinnung der gewünschten cDNA.

Question 4

Wie unterscheidet sich 5' RACE von 3' RACE beim Ermitteln unbekannter Sequenzen?

Accepted Answer

In 5' RACE bindet ein genspezifischer Primer das 3'-Ende der mRNA während der reversen Transkription, dann fügt die terminale Desoxynukleotidyltransferase einen Poly-A-Schwanz zum 3'-Ende der cDNA hinzu. Ein Adapterprimer mit Oligo-dT- und Ankersequenzen synthetisiert dann den komplementären Strang, um die fehlende 5'-Sequenz zu amplifizieren.

Question 5

Was sind degenerierte Primer und warum können sie bei RACE Probleme verursachen?

Accepted Answer

Degenerierte Primer werden als mögliche cDNA-Endsequenzen konzipiert, die aus Aminosäuresequenzen von kodierten Proteinen vorhergesagt werden. Da Aminosäuren durch mehrere mRNA-Codons codiert werden, ist die Vorhersage von Nukleotidsequenz aus Proteinsequenzen ungenau, was dazu führt, dass degenerierte Primer unerwünschte PCR-Produkte erzeugen.

Question 6

Wie verbessern GI-Endprimer die RACE-Spezifität im Vergleich zu G-reichen Primern?

Accepted Answer

GI-Schwanz-Primer enthalten eine Mischung aus Guaninen und Inosin, was die PCR-Spezifität erhöht und die unerwünschte Amplifikation reduziert. Im Gegensatz zu G-reichen Primern, die deutlich höhere Anlagerungstemperaturen erfordern, lagern sich GI-Schwanz-Primer bei Standard-PCR-Temperaturen an, was sie für routinemäßige RACE-Anwendungen praktischer macht.

Question 7

Welche Modifikationen verbessern die Leistung der RACE-Technik für die Gewinnung vollständiger cDNA?

Accepted Answer

RACE-Modifikationen umfassen die Optimierung von Ankersequenzen, die Anpassung von Primersequenzen an spezifische cDNAs, die Verwendung von degenerierten Primern, die Kontrolle der GC-Zusammensetzung, die Anpassung der cDNA-Endlänge und den Einsatz von Poly(C)-Schwänzen mit GI-Schwanz-Hybridprimern. Diese Verbesserungen erhöhen die Spezifität und Ausbeute vollständiger cDNA-Sequenzen durch Next-Generation-Sequencing reversible terminator-Ansätze.

RACE – Schnelle Amplifikation von cDNA-Enden

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