16.12:

16.12: In-situ-Hybridisierung

In-situ Hybridization

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Molecular Biology

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In-situ Hybridization

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16.11: Reporter Genes

16.13: Chromatin Immunoprecipitation- ChIP

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02:31 min

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April 07, 2021

Overview

Die In-situ-Hybridisierung (ISH) ist eine Technik zum Nachweis und zur Lokalisierung spezifischer DNA- oder RNA-Moleküle in Zellen, Geweben oder Gewebeschnitten mit einer markierten Sonde. Die Technik wurde erstmals 1969 für die Untersuchung von Nukleinsäuren eingesetzt. Es ist derzeit ein unverzichtbares Instrument in der wissenschaftlichen Forschung und im klinischen Umfeld, insbesondere für diagnostische Zwecke.

Arten von Sonden und Etiketten

Eine Sonde ist ein komplementärer DNA- oder RNA-Strang, der an entsprechende Nukleotidsequenzen in einer Zelle bindet. Bei der In-situ-Hybridisierung werden viele verschiedene Sonden verwendet, wie z. B. einzelsträngige DNA-Sonden, doppelsträngige DNA-Sonden, Antisense-RNA-Sonden oder Ribosonden und synthetische Oligodesoxynukleotidsonden. Die Wahl der Sonde hängt von mehreren Faktoren ab, darunter ihre Empfindlichkeit, Spezifität, Stabilität und einfache Penetration in die Gewebeprobe.

Diese Sonden können zu Nachweiszwecken mit Radioisotopen, Fluoreszenzfarbstoffen oder anderen Antigenmolekülen markiert werden. Die ³H, ³⁵S und ³²P sind weit verbreitete radioaktiv markierte Sonden, während zu den nicht-radioaktiven Markierungen Biotin, Digoxigenin und Fluorescein gehören. Diese Markierungen können durch Endmarkierung, Nick-Translation oder zufällige Primersynthesemethoden an das DNA-Molekül der Sonde angehängt werden. Nachweismethoden wie Autoradiographie, Fluoreszenzmikroskopie oder Immunhistochemie werden für die Zielvisualisierung auf der Grundlage der an der hybridisierten Sonde angebrachten Markierung verwendet.

**Vor- und Nachteile der in situ Hybridisierung**

Einer der Hauptvorteile der In-situ-Hybridisierung besteht darin, dass sie sogar auf gefrorenes Gewebe angewendet werden kann, um eine maximale Nutzung von schwer zu gewinnenden Geweben zu ermöglichen. Darüber hinaus kann es mit anderen Techniken, wie z. B. der Immunhistochemie, kombiniert werden, um Proteine und aktive mRNA in der Probe nachzuweisen. Bei der Arbeit mit Proben mit geringen DNA- und RNA-Kopien kann es jedoch schwierig sein, Ziele durch In-situ-Hybridisierung zu identifizieren.

Transcript

Die In-situ-Hybridisierung ist eine Technik, die verwendet wird, um DNA oder RNA in kultivierten Zellen oder in chemisch konservierten Gewebeschnitten zu lokalisieren.

Die RNA-in-situ-Hybridisierung wird verwendet, um zu überwachen, wo ein Gen exprimiert wird, indem die spezifischen mRNA-Transkripte nachgewiesen und quantifiziert werden.

Die Ziel-mRNAs werden durch einzelsträngige, komplementäre RNA-Sonden nachgewiesen, die durch In-vitro-Transkription eines DNA-Templates hergestellt oder durch eine chemische Reaktion synthetisiert werden.

Die Sonden sind mit radioaktiven Isotopen, Fluorophoren oder anderen Reportermolekülen wie Biotin oder Digoxigenin markiert, die von einem markierten Antikörper gebunden und nachgewiesen werden können.

Die RNA-in-situ-Hybridisierung besteht aus vier Hauptschritten: Gewebefixierung, Permeabilisierung, Hybridisierung und Detektion.

Zu Beginn wird frisches Gewebe entnommen und chemisch behandelt, um alle biochemischen Reaktionen im Gewebe zu stoppen und seine strukturelle Integrität zu erhalten. Diese Konservierungstechnik wird als Gewebefixierung bezeichnet.

Als nächstes müssen Proteine und Lipide im Gewebe entfernt werden, damit die Sonde auf die Ziel-RNA zugreifen und sie binden kann.

Um die Proteine abzubauen und die Zellmembran zu permeabilisieren, wird die Probe mit 0,2 molare Salzsäure und Enzymen wie Proteinasen behandelt, während Detergenzien zum Abbau der Lipide verwendet werden.

Die Ziel-RNA wird dann mit den Sonden bei einer Temperatur knapp unter dem Schmelzpunkt des RNA-Sonden-Hybrids hybridisiert. Dies hilft den Sonden, mit den komplementären mRNAs zu annealen. Ungebundene und lose gebundene Sonden werden durch mehrere Waschgänge entfernt.

Die Methode zum Nachweis der hybridisierten Sonden hängt von der Art der Markierung ab. Radioaktive Sonden werden mit fotografischen Filmen belichtet, während Fluoreszenzsonden unter Fluoreszenzmikroskopen sichtbar sind.

Für andere Markierungen werden Antikörper gegen das Reportermolekül mit einem fluoreszierenden oder kolorimetrischen Farbstoff markiert.

Der Nachweis hybridisierter Sonden zeigt die Verteilung spezifischer mRNAs, die anzeigen, wo die interessierenden Gene exprimiert werden.

Key Terms and definitions

Learning Objectives

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