5.12
In-situ-Hybridisierung
Die In-situ-Hybridisierung (ISH) ist eine Technik zur Detektion und Lokalisierung spezifischer DNA- oder RNA-Moleküle in Zellen, Geweben oder Gewebesc…
Die In-situ-Hybridisierung ist eine Technik, die verwendet wird, um DNA oder RNA in kultivierten Zellen oder in chemisch konservierten Gewebeschnitten zu lokalisieren.
Die RNA-in-situ-Hybridisierung wird verwendet, um zu überwachen, wo ein Gen exprimiert wird, indem die spezifischen mRNA-Transkripte nachgewiesen und quantifiziert werden.
Die Ziel-mRNAs werden durch einzelsträngige, komplementäre RNA-Sonden nachgewiesen, die durch In-vitro-Transkription eines DNA-Templates hergestellt oder durch eine chemische Reaktion synthetisiert werden.
Die Sonden sind mit radioaktiven Isotopen, Fluorophoren oder anderen Reportermolekülen wie Biotin oder Digoxigenin markiert, die von einem markierten Antikörper gebunden und nachgewiesen werden können.
Die RNA-in-situ-Hybridisierung besteht aus vier Hauptschritten: Gewebefixierung, Permeabilisierung, Hybridisierung und Detektion.
Zu Beginn wird frisches Gewebe entnommen und chemisch behandelt, um alle biochemischen Reaktionen im Gewebe zu stoppen und seine strukturelle Integrität zu erhalten. Diese Konservierungstechnik wird als Gewebefixierung bezeichnet.
Als nächstes müssen Proteine und Lipide im Gewebe entfernt werden, damit die Sonde auf die Ziel-RNA zugreifen und sie binden kann.
Um die Proteine abzubauen und die Zellmembran zu permeabilisieren, wird die Probe mit 0,2 molare Salzsäure und Enzymen wie Proteinasen behandelt, während Detergenzien zum Abbau der Lipide verwendet werden.
Die Ziel-RNA wird dann mit den Sonden bei einer Temperatur knapp unter dem Schmelzpunkt des RNA-Sonden-Hybrids hybridisiert. Dies hilft den Sonden, mit den komplementären mRNAs zu annealen. Ungebundene und lose gebundene Sonden werden durch mehrere Waschgänge entfernt.
Die Methode zum Nachweis der hybridisierten Sonden hängt von der Art der Markierung ab. Radioaktive Sonden werden mit fotografischen Filmen belichtet, während Fluoreszenzsonden unter Fluoreszenzmikroskopen sichtbar sind.
Für andere Markierungen werden Antikörper gegen das Reportermolekül mit einem fluoreszierenden oder kolorimetrischen Farbstoff markiert.
Der Nachweis hybridisierter Sonden zeigt die Verteilung spezifischer mRNAs, die anzeigen, wo die interessierenden Gene exprimiert werden.
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Q1: What is in situ hybridization used for in molecular biology?
In situ hybridization is a technique that detects and localizes specific DNA or RNA molecules in cultured cells or preserved tissue sections. RNA in situ hybridization specifically monitors where genes are expressed by detecting and quantifying mRNA transcripts using complementary RNA probes labeled with radioactive isotopes, fluorophores, biotin, or digoxigenin for visualization.
Q2: What are the four main steps of RNA in situ hybridization?
The four main steps are tissue fixation, permeabilization, hybridization, and detection. Tissue fixation chemically preserves structural integrity. Permeabilization removes proteins and lipids using hydrochloric acid, proteinases, and detergents to allow probe access. Hybridization anneals probes to complementary mRNAs at controlled temperatures. Detection reveals mRNA distribution using methods suited to the probe label type.
Q3: How do different probe labels affect detection in in situ hybridization?
Detection methods depend on the probe label type. Radioactive probes are exposed to photographic films via autoradiography. Fluorescent probes are visualized under fluorescent microscopes. For other labels like biotin or digoxigenin, antibodies tagged with fluorescent or colorimetric dyes bind the reporter molecule for visualization, enabling flexible detection strategies.
Q4: What types of probes are used in in situ hybridization?
Multiple probe types are employed, including single-stranded DNA probes, double-stranded DNA probes, antisense RNA probes (riboprobes), and synthetic oligodeoxynucleotide probes. Probe selection depends on sensitivity, specificity, stability, and tissue penetration ability. These probes are complementary strands that bind to corresponding nucleotide sequences in cells or tissue samples.
Q5: Why is tissue permeabilization necessary in in situ hybridization?
Tissue permeabilization removes proteins and lipids that block probe access to target RNA. The sample is treated with hydrochloric acid and proteinases to degrade proteins and permeabilize cell membranes, while detergents break down lipids. This step ensures probes can penetrate tissue and successfully anneal with complementary mRNA sequences.
Q6: What are the advantages of in situ hybridization for gene expression analysis?
In situ hybridization can be applied to frozen tissues, maximizing use of difficult-to-obtain samples. It can be combined with other techniques like immunohistochemistry to detect both protein and active mRNA simultaneously. However, samples with low DNA and RNA copy numbers may present challenges for target identification.
Q7: How are probes labeled and detected in in situ hybridization?
Probes are labeled using radioisotopes (3H, 35S, 32P), non-radioactive labels (biotin, digoxigenin, fluorescein), or fluorescent dyes attached via end-labeling, nick-translation, or random primer synthesis. These labeled probes enable detection through reporter genes or antibodies tagged with fluorescent or colorimetric dyes, allowing visualization of hybridized target sequences.