16.12: In-situ-Hybridisierung

Die In-situ-Hybridisierung (ISH) ist eine Technik zum Nachweis und zur Lokalisierung spezifischer DNA- oder RNA-Moleküle in Zellen, Geweben oder Gewebeschnitten mit einer markierten Sonde. Die Technik wurde erstmals 1969 für die Untersuchung von Nukleinsäuren eingesetzt. Es ist derzeit ein unverzichtbares Instrument in der wissenschaftlichen Forschung und im klinischen Umfeld, insbesondere für diagnostische Zwecke.

Arten von Sonden und Etiketten

Eine Sonde ist ein komplementärer DNA- oder RNA-Strang, der an entsprechende Nukleotidsequenzen in einer Zelle bindet. Bei der In-situ-Hybridisierung werden viele verschiedene Sonden verwendet, wie z. B. einzelsträngige DNA-Sonden, doppelsträngige DNA-Sonden, Antisense-RNA-Sonden oder Ribosonden und synthetische Oligodesoxynukleotidsonden. Die Wahl der Sonde hängt von mehreren Faktoren ab, darunter ihre Empfindlichkeit, Spezifität, Stabilität und einfache Penetration in die Gewebeprobe.

Diese Sonden können zu Nachweiszwecken mit Radioisotopen, Fluoreszenzfarbstoffen oder anderen Antigenmolekülen markiert werden. Die ³H, ³⁵S und ³²P sind weit verbreitete radioaktiv markierte Sonden, während zu den nicht-radioaktiven Markierungen Biotin, Digoxigenin und Fluorescein gehören. Diese Markierungen können durch Endmarkierung, Nick-Translation oder zufällige Primersynthesemethoden an das DNA-Molekül der Sonde angehängt werden. Nachweismethoden wie Autoradiographie, Fluoreszenzmikroskopie oder Immunhistochemie werden für die Zielvisualisierung auf der Grundlage der an der hybridisierten Sonde angebrachten Markierung verwendet.

Vor- und Nachteile der in situ Hybridisierung

Einer der Hauptvorteile der In-situ-Hybridisierung besteht darin, dass sie sogar auf gefrorenes Gewebe angewendet werden kann, um eine maximale Nutzung von schwer zu gewinnenden Geweben zu ermöglichen. Darüber hinaus kann es mit anderen Techniken, wie z. B. der Immunhistochemie, kombiniert werden, um Proteine und aktive mRNA in der Probe nachzuweisen. Bei der Arbeit mit Proben mit geringen DNA- und RNA-Kopien kann es jedoch schwierig sein, Ziele durch In-situ-Hybridisierung zu identifizieren.