Chromatin-Immunpräzipitation – ChIP

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Die Chromatin-Immunpräzipitation, abgekürzt ChIP, ist eine Technik zur Untersuchung der Protein-DNA-Wechselwirkungen, die die Genexpression regulieren.

In Eukaryoten ist die DNA um Histonproteine gewickelt und bildet einen Komplex, der als Nukleosom bekannt ist und sich weiter zu einer Struktur gruppiert, die als Chromatin bekannt ist, um die dichte Verpackung der DNA in den Zellen zu unterstützen.

Die Genexpression wird durch Histonmodifikationen reguliert, die diese Strukturen aufwickeln oder verengen, sowie durch Proteine, die mit cis-regulatorischen Regionen auf der DNA assoziiert sind.

Bei ChIP wird das Chromatin abgebaut und Antikörper, die an Histonmodifikationen oder regulatorische Proteine binden, werden verwendet, um die Zielmoleküle mit der zugehörigen DNA zu isolieren.

Der erste Schritt in diesem Prozess besteht darin, das Protein mit Hilfe eines Vernetzungsmittels wie Formaldehyd mit der DNA zu vernetzen, wodurch das Protein auf der DNA immobilisiert wird und die Bindungsstelle des Proteins markiert wird. Nach der Vernetzung wird das Chromatin mechanisch in kurze Fragmente von 100 bis 200 Basenpaaren geschert. Dieser Prozess wird als X-ChIP bezeichnet.

Eine alternative Methode ist N-ChIP, bei der Nukleasen DNA aus dem Chromatin direkt in kurze Fragmente verdauen, ohne vorherige Vernetzung

Die Immunpräzipitation erfolgt durch die Einführung von Antikörpern, die auf die regulatorischen Proteine in der Lösung abzielen, die gescherte oder verdaute DNA enthält. Diese Antikörper sind mit Wirkstoffen verknüpft, die bei der selektiven Isolierung helfen.

Eine gängige Methode ist die Verknüpfung der Antikörper mit magnetischen Kügelchen. Ein Magnet wird verwendet, um die Antikörper zusammen mit den gebundenen Molekülen zu isolieren.

Der Komplex wird gespült, um lose verbundene Verunreinigungen abzuwaschen. Die Zielmoleküle werden mit Hilfe eines Reinigungsmittels, wie z. B. SDS, abgelöst.

Im Falle von X-ChiP wird die Vernetzung mit Hilfe erhöhter Temperaturen rückgängig gemacht und die zugehörigen Regulatoren oder Histone werden mit Hilfe von Proteasen abgebaut, wobei die DNA zurückbleibt.

Die Sequenzierung der assoziierten DNA kann helfen, die cis-regulatorische Sequenz zu identifizieren, an die das Protein von Interesse gebunden war, oder das Gen, dessen Expression durch eine bestimmte Histonmodifikation moduliert wird.

Overview

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Die Chromatin-Immunpräzipitation, oder ChIP, ist eine antikörperbasierte Technik, die verwendet wird, um Stellen auf der DNA zu identifizieren, an die Transkriptionsfaktoren von Interesse oder Histonproteine binden. Sie hilft auch, die Art der Histonmodifikationen wie Acetylierung, Phosphorylierung oder Methylierung zu bestimmen.

Arten von ChIP

ChIP kann in zwei Typen unterteilt werden - X-ChIP und N-ChIP. X-ChIP beinhaltet das in vivo Vernetzen von Histonen und regulatorischen Proteinen mit der DNA, das Fragmentieren der DNA durch Sonikation und das Isolieren der Protein-DNA-Komplexe durch Immunpräzipitation mit spezifischen Antikörpern. Im Gegensatz dazu beinhaltet N-ChIP kein Vernetzen von DNA mit Proteinen, und die Verdauung erfolgt mittels Nukleasen.

Nachgelagerte Analyse von DNA-Protein-Interaktionen

Nach der Isolierung der interessierenden DNA können Techniken wie PCR, Mikroarrays oder Southern-Blot zur Analyse verwendet werden. Alternativ kann diese DNA für die Tiefensequenzierung verwendet werden, bekannt als ChIP-Seq. ChIP kann durch andere Methoden für verschiedene Analysen modifiziert werden, wie ChIA-PET, eine Technik, die die Prinzipien von ChIP mit der Chromosomenkonformations-Erfassung kombiniert, um langreichweitige Chromatin-Interaktionen zu erkennen, die über ein Protein von Interesse vermittelt werden; enChIP, eine Technik, die das CRISPR/Cas9-System verwendet, um spezifische genomische Regionen zu zielen; und RIP-ChIP/RIP-Seq, eine Modifikation von ChIP, die verwendet wird, um Protein-RNA-Interaktionen zu analysieren.

Vergleich zwischen N-ChIP und X-ChIP

N-ChIP und X-ChIP haben ihre eigenen Vor- und Nachteile. N-ChIP führt zu einer stärkeren Antikörperbindung und einer effizienten und hochspezifischen Immunpräzipitation. Allerdings eignet sich N-ChIP nur, wenn die Proteine, wie Histone, fest gebunden sind, da Transkriptionsfaktoren während der Verarbeitung abgelöst werden können. Zusätzlich wird nicht das gesamte nuklease-verdaute Chromatin gelöst, was dazu führt, dass bestimmte Fraktionen der Probe fehlen. X-ChIP ist eine hervorragende Methodik für die Untersuchung von Transkriptionsfaktoren, die nicht fest an die DNA gebunden sind, dank des Vernetzungsschritts. Der X-ChIP-Assay ist auch empfindlicher als N-ChIP und benötigt geringere Mengen an Proben sowie Antikörpern. Nachteile von X-ChIP umfassen mögliche Schwierigkeiten bei der Fragmentierung aufgrund übermäßiger Vernetzung und falsch positive Ergebnisse durch die Vernetzung von transienten DNA-Protein-Interaktionen.