16.13: Chromatin-Immunpräzipitation - ChIP

Die Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) ist eine antikörperbasierte Technik, die zur Identifizierung von Stellen auf der DNA verwendet wird, die an interessante Transkriptionsfaktoren oder Histonproteine binden. Es hilft auch bei der Bestimmung der Art von Histonmodifikationen wie Acetylierung, Phosphorylierung oder Methylierung.

Arten von ChIP

ChIP kann in zwei Typen unterteilt werden – X-ChIP und N-ChIP. X-ChIP beinhaltet in vivo die Vernetzung von Histonen und regulatorischen Proteinen mit der DNA, die Fragmentierung der DNA durch Beschallung und die Isolierung der Protein-DNA-Komplexe durch Immunpräzipitation mit spezifischen Antikörpern. Auf der anderen Seite beinhaltet N-ChIP keine Vernetzung von DNA mit Proteinen, und die Verdauung erfolgt mithilfe von Nukleasen.

Downstream-Analyse von DNA-Protein-Wechselwirkungen

Nach der Isolierung der interessierenden DNA können Techniken wie PCR, Microarrays oder Southern Blot zur Analyse verwendet werden. Alternativ kann diese DNA für die Tiefensequenzierung, bekannt als ChIP-Seq, verwendet werden. ChIP kann mit anderen Methoden für verschiedene Analysen modifiziert werden, wie z. B. ChIA-PET, eine Technik, die die Prinzipien von ChIP mit der Erfassung von Chromosomenkonformationen kombiniert, um Chromatininteraktionen mit großer Reichweite zu erkennen, die über ein Protein von Interesse vermittelt werden; enChIP, eine Technik, die das CRISPR/Cas9-System verwendet, um bestimmte genomische Regionen zu adressieren, und RIP-ChIP/RIP-Seq, eine Modifikation von ChIP, die zur Analyse von Protein-RNA-Wechselwirkungen verwendet wird.

Vergleich zwischen N-ChIP und X-ChIP

N-ChIP und X-ChIP haben ihre eigenen Vor- und Nachteile. N-ChIP führt zu einer stärkeren Antikörperbindung und einer effizienten und hochspezifischen Immunpräzipitation. N-ChIP ist jedoch nur bei fest gebundenen Proteinen wie Histonen geeignet, da sich Transkriptionsfaktoren während der Prozessierung ablösen können. Darüber hinaus wird nicht das gesamte Nuklease-verdaute Chromatin solubilisiert, was dazu führt, dass bestimmte Fraktionen der Probe fehlen. X-ChIP ist eine hervorragende Methode zur Untersuchung von Transkriptionsfaktoren, die aufgrund ihres Vernetzungsschritts nicht fest an die DNA gebunden sind. Der X-ChIP-Assay ist auch empfindlicher als der N-ChIP und erfordert geringere Mengen an Proben sowie Antikörpern. Zu den Nachteilen des X-Chips gehören mögliche Schwierigkeiten bei der Fragmentierung aufgrund übermäßiger Vernetzung und falsch positive Ergebnisse aufgrund der Vernetzung von transienten DNA-Protein-Wechselwirkungen.