16.15: Ribosomen-Profilierung

Ribosomen-Profiling oder Ribo-Sequenzierung ist eine tiefe Sequenzierungstechnik, die eine Momentaufnahme der aktiven Translation in einer Zelle erstellt. Es sequenziert selektiv die durch Ribosomen geschützten mRNAs, um einen Einblick in die Translationslandschaft einer Zelle zu einem bestimmten Zeitpunkt zu erhalten.

Anwendungen des Ribosomen-Profilings

Die Erstellung von Ribosomenprofilen hat viele Anwendungen, einschließlich der In-vivo-Überwachung der Translation in einem bestimmten Organ oder Gewebetyp und der Quantifizierung neuer Proteinsyntheseniveaus.

Die Technik hilft bei der Identifizierung translatierter offener Leserahmen und der Entdeckung neuer translatierter Produkte, einschließlich kurzer Peptide und Isoformen charakterisierter Proteine mit unbekannten Funktionen. Das Ribosomen-Profiling hilft auch bei der Identifizierung mehrerer mRNAs in der Zelle, die erst translatiert werden, wenn sie ein externes Signal erhalten.

Technische Herausforderungen bei der Ribosomen-Profilierung

Die Erstellung von Ribosomen-Profilen steht vor vielen technischen Herausforderungen, wie z. B. der Anforderung großer Probenmengen, der Zuverlässigkeit bei der rechtzeitigen Hemmung der Translation und der RNA-Kontamination.

Die Schockfrosttechnik kann die Herausforderung der schnellen Translationshemmung überwinden. Es hilft, die Ribosomenverteilung innerhalb der Zellen im Vergleich zu Translationsdehnungshemmern wie Cycloheximid effizient zu erfassen.

Ribosomale RNA (rRNA), die an die mRNA bindet, wird in der Regel bei der Ribosomenprofilierung entfernt. Manchmal werden jedoch immer noch einige wenige rRNA-Verunreinigungen beobachtet. Die Forscher verwenden das Enzym Duplex-spezifische Nuklease (DSN), um die rRNA-Kontamination zu reduzieren, das aus der Hepatopankreas der Kamtschatka-Krabbe isoliert wurde und dsDNA- und DNA-RNA-Hybride spaltet. Diese Methode wird häufig auch verwendet, um cDNA-Bibliotheken vor der Next-Generation-Sequenzierung und der Erschöpfung von rRNA aus RNA-seq-Bibliotheken zu normalisieren.

Eine weitere Einschränkung des Ribosomenprofilings liegt bei der Analyse von Daten, die das richtige Fachwissen in der Bioinformatik erfordert. Um dieses Problem zu beheben, wird ein R-Paket riboSeqR verwendet, das Methoden zum Auflösen von ribosomalen Profiling-Daten für mehrere Proben bereitstellt.