Ribosomen-Profiling

Die Identifizierung von Regionen in einem Genom, die transkribiert und in Proteine übersetzt werden, ist ein wichtiger Schritt zum Verständnis eines Genoms und seiner Expression.

Dies wird mit einer Technik namens Ribosomenprofilierung erreicht, die auch als Ribo-Seq bezeichnet wird. Es kartiert die Positionen von Ribosomen auf mRNA und identifiziert mRNAs, die aktiv in Proteine übersetzt werden.

Um die RNA zu isolieren, müssen die Zellen zunächst lysiert werden, um an die darin enthaltenen Moleküle zu gelangen. Das Lysat wird dann mit RNasen behandelt. Diese Enzyme spalten die mRNAs, die nicht mit Ribosomen bedeckt sind, so dass nur die geschützten mRNA-Fragmente übrig bleiben.

Die ribosomengeschützten Fragmente werden dann mit Hilfe eines Saccharosegradienten von den ungeschützten, gespaltenen Fragmenten getrennt.

Anschließend werden die Ribosomen aus den mRNA-Fragmenten entfernt und die RNA mittels RT-PCR mit dem Enzym reverse Transkriptase in DNA umgewandelt.

Als nächstes wird die DNA sequenziert und auf dem Referenzgenom kartiert. Dadurch wird die genaue Position des Ribosoms entlang jeder mRNA bestimmt.

Die Erstellung von Ribosomenprofilen kann auch helfen, unerkannte offene Leserahmen oder ORFs zu identifizieren. Ein ORF ist eine DNA-Region zwischen einem Start- und einem Stoppcodon, die in ein Protein übersetzt werden kann. Das Auffinden von ORFs kann bei der Identifizierung neuer Gene hilfreich sein.

Denken Sie an die Untersuchung von Genexpressionsmustern in einer Säugetierzelllinie. Das experimentelle Verfahren besteht darin, die Zellen Stimuli auszusetzen, die die Genexpression aktivieren und die mRNA-Synthese initiieren können.

Die mRNAs, die aktiv translatiert werden, werden mittels Ribosomen-Profiling identifiziert.

Dieses Experiment zeigt, dass Gen B translatiert wird, während die Gene A und C dies nicht tun.

Es zeigt auch, dass eine weitere kleine Region des Genoms, die etwa hundert Nukleotide lang ist, aktiv translatiert wird.

Diese unerkannte Region ist ein offener Leserahmen, der für ein neuartiges Protein kodieren kann, das durch die experimentellen Stimuli hochreguliert wird.