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Ribosomen-Profiling
Das Ribosomen-Profiling oder Ribo-Sequenzierung ist eine Tiefensequenzierungstechnik, die eine Momentaufnahme der aktiven Translation in einer Zelle l…
Die Identifizierung von Regionen in einem Genom, die transkribiert und in Proteine übersetzt werden, ist ein wichtiger Schritt zum Verständnis eines Genoms und seiner Expression.
Dies wird mit einer Technik namens Ribosomenprofilierung erreicht, die auch als Ribo-Seq bezeichnet wird. Es kartiert die Positionen von Ribosomen auf mRNA und identifiziert mRNAs, die aktiv in Proteine übersetzt werden.
Um die RNA zu isolieren, müssen die Zellen zunächst lysiert werden, um an die darin enthaltenen Moleküle zu gelangen. Das Lysat wird dann mit RNasen behandelt. Diese Enzyme spalten die mRNAs, die nicht mit Ribosomen bedeckt sind, so dass nur die geschützten mRNA-Fragmente übrig bleiben.
Die ribosomengeschützten Fragmente werden dann mit Hilfe eines Saccharosegradienten von den ungeschützten, gespaltenen Fragmenten getrennt.
Anschließend werden die Ribosomen aus den mRNA-Fragmenten entfernt und die RNA mittels RT-PCR mit dem Enzym reverse Transkriptase in DNA umgewandelt.
Als nächstes wird die DNA sequenziert und auf dem Referenzgenom kartiert. Dadurch wird die genaue Position des Ribosoms entlang jeder mRNA bestimmt.
Die Erstellung von Ribosomenprofilen kann auch helfen, unerkannte offene Leserahmen oder ORFs zu identifizieren. Ein ORF ist eine DNA-Region zwischen einem Start- und einem Stoppcodon, die in ein Protein übersetzt werden kann. Das Auffinden von ORFs kann bei der Identifizierung neuer Gene hilfreich sein.
Denken Sie an die Untersuchung von Genexpressionsmustern in einer Säugetierzelllinie. Das experimentelle Verfahren besteht darin, die Zellen Stimuli auszusetzen, die die Genexpression aktivieren und die mRNA-Synthese initiieren können.
Die mRNAs, die aktiv translatiert werden, werden mittels Ribosomen-Profiling identifiziert.
Dieses Experiment zeigt, dass Gen B translatiert wird, während die Gene A und C dies nicht tun.
Es zeigt auch, dass eine weitere kleine Region des Genoms, die etwa hundert Nukleotide lang ist, aktiv translatiert wird.
Diese unerkannte Region ist ein offener Leserahmen, der für ein neuartiges Protein kodieren kann, das durch die experimentellen Stimuli hochreguliert wird.
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Q1: What is ribosome profiling and what does it measure?
Ribosome profiling, also called ribo-seq, is a deep sequencing technique that maps ribosome positions on mRNA to identify actively translated genes. It produces a snapshot of the translation landscape in a cell at any given moment by selectively sequencing mRNAs protected by ribosomes, revealing which genes are being translated into proteins.
Q2: How does ribosome profiling isolate and protect mRNA fragments?
Cells are lysed to access internal molecules, then the lysate is treated with RNases that cleave unprotected mRNAs. Ribosomes shield their bound mRNA from cleavage, leaving only ribosome-protected fragments. These protected fragments are then separated from cleaved fragments using a sucrose gradient for further analysis.
Q3: What role do open reading frames play in ribosome profiling analysis?
Ribosome profiling identifies open reading frames (ORFs), which are DNA regions between start and stop codons that can be translated into proteins. Discovering unrecognized ORFs helps identify new genes and novel proteins. In experimental studies, ribosome profiling can reveal previously unknown translated regions upregulated by specific cellular stimuli.
Q4: How is ribosomal RNA contamination addressed in ribosome profiling?
Ribosomal RNA (rRNA) that binds to mRNA is typically removed during ribosome profiling. However, rRNA contaminants sometimes persist. Researchers use the duplex-specific nuclease (DSN) enzyme, isolated from the Kamchatka crab hepatopancreas, which cleaves dsDNA and DNA-RNA hybrids to reduce rRNA contamination in samples.
Q5: What technical challenges does ribosome profiling face?
Ribosome profiling requires large sample amounts, timely translation inhibition, and managing RNA contamination. Flash-freezing efficiently captures ribosome distribution compared to elongation inhibitors like cycloheximide. Data analysis also demands bioinformatics expertise; the riboSeqR R package helps overcome this limitation by providing methods for resolving profiling data across multiple samples.
Q6: How does ribosome profiling convert mRNA to DNA for sequencing?
After ribosomes are removed from protected mRNA fragments, the RNA is converted into DNA using reverse transcriptase through RT-PCR. The resulting DNA is then sequenced and mapped onto a reference genome to determine the exact ribosome location along each mRNA molecule.
Q7: What applications does ribosome profiling have in studying gene expression?
Ribosome profiling enables in vivo monitoring of translation in specific organs or tissues and quantifies new protein synthesis levels. It discovers translated products including short peptides and protein isoforms with unknown functions. The technique also identifies mRNAs that remain untranslated until receiving external signals, revealing dynamic translation regulation.