32.8: Prinzipien der Säulenchromatographie

Die Chromatographietechnik wurde erstmals 1901 von Michael S. Tswett, einem russischen Botaniker, erfunden, um Pflanzenpigmente mithilfe organischer Lösungsmittel zu trennen. Darüber hinaus modifizierten Archer John Porter Martin und R. L. M. Synge 1941 die Technik, indem sie Kieselgel in eine Säule packten. Anschließend wurde eine Mischung aus Aminosäuren auf der Füllkörpersäule unter Verwendung einer Mischung aus Chloroform und Wasser als mobile Phase aufgetrennt. Dies war der erste Bericht über Säulenchromatographie. Derzeit ist die Säulenchromatographie eine weit verbreitete Technik zur Trennung verschiedener Arten von Verbindungen aus einer Probenmischung.

Faktoren, die eine effiziente Trennung von Proteinen beeinflussen

Verschiedene Parameter wie Säulenmaterial, Packung und Betriebsbedingungen wie Flussraten und Temperatur bestimmen die Effizienz der Trennung durch Säulenchromatographie.

Die Wahl des Säulenmaterials oder der Matrix bestimmt das Ausmaß der Wechselwirkung mit der Probe. Das Matrixmaterial muss dicht und gleichmäßig in der Säule gepackt sein. Luftblasen, Ablagerungen, große Partikel und Niederschläge stören den gleichmäßigen Fluss des Lösungsmittels durch die Säule und beeinträchtigen deren Trenneffizienz. Die Säule sollte außerdem frei von Partikeln sein.

Die in die Säule injizierte Probe sollte klar und frei von Aggregaten sein, die die Säule verstopfen und den Lösungsmittelfluss behindern könnten. Auch die Fließgeschwindigkeit des Lösungsmittels beeinflusst die Trennung. Sehr hohe oder sehr niedrige Lösungsmitteldurchflussraten führen zu einer ineffizienten Trennung von Verbindungen und unreinen Zubereitungen. Sehr hohe Raten können auch die Säulenpackung stören und die Prozesseffizienz beeinträchtigen. Darüber hinaus ist auch die Zusammensetzung des Elutionspuffers ein wichtiger Faktor. Es sollte nicht korrodierend und mit der Probe sowie dem Säulenmaterial kompatibel sein, um eine Ausfällung oder Auflösung in situ zu verhindern.

Auch ein weiterer Betriebsparameter, die Temperatur, spielt dabei eine wichtige Rolle. Sie entscheidet über die Stabilität der Probe, des Säulenmaterials und des Lösungsmittelpuffers. Außerdem löst eine konstante Temperatur in der gesamten Säule Verbindungen effizient auf. Nach Abschluss des Trennvorgangs müssen die Säulen durch wiederholtes Durchleiten eines geeigneten Lösungsmittels gründlich gewaschen werden, um eine Probenkontamination in weiteren Läufen zu vermeiden. Gelegentlich wird das Lösungsmittel in umgekehrter Richtung durch eine Säule geleitet, um verstopftes Material zu entfernen.

Einschränkungen

Obwohl es sich um eine sehr weit verbreitete Technik handelt, weist die Methode dennoch einige Einschränkungen auf. Es handelt sich um eine sehr zeitaufwändige Methode, da die Flussraten für eine bessere Auflösung der Verbindungen langsamer sein müssen. Außerdem machen große Mengen an hochreinen Lösungsmitteln, die in der mobilen Phase benötigt werden, das Verfahren teuer. Dies erhöht auch die Scale-up-Kosten, wenn höhere Ausbeuten an reinen Verbindungen benötigt werden.

Die Säulenchromatographie ist eine biochemische Technik, mit der Verbindungen auf der Grundlage ihrer physikalischen und chemischen Eigenschaften getrennt werden.

Es besteht aus zwei Hauptkomponenten: der festen stationären Phase oder der Matrix und der flüssigen mobilen Phase oder dem Lösungsmittel.

Die matrixgepackte Säule wird mit einer Probe, z. B. einer Proteinmischung, beladen. Das Lösungsmittel wird dann verwendet, um die Probe durch die Säule zu transportieren.

Im Inneren der Säule fungiert die Matrix als molekulares Netz, das die Proteine basierend auf ihrer Größe oder Wechselwirkung mit der Matrix filtert. Die größeren Proteine neigen dazu, sich schneller zu bewegen als die kleineren Proteine, was zu einer größenbasierten Trennung führt.

Darüber hinaus können Proteine in einer Probe mit der Matrix interagieren. Schwache Wechselwirkungen ermöglichen es Proteinen, schnell zu passieren, während starke Wechselwirkungen Proteine in der Säule halten.

Eine allmähliche Änderung des pH-Werts oder der Ionenstärke des Lösungsmittels verändert die Wechselwirkungen der Proteine mit der Matrix und hilft, Proteine in separate Fraktionen zu eluieren.