Hochauflösendes Video Tracking von Locomotion in Adult Drosophila melanogaster

Zusammenfassung

Die Untersuchung der komplexen Bewegungsapparat Verhalten in Drosophila melanogaster Ist abhängig von der Fähigkeit, Veränderungen in einem bestimmten Fliege Bewegung zu quantifizieren. Dieser Artikel zeigt, wie Sie dies tun mit einer hochauflösenden Tracking-System.

Zusammenfassung

Fliegen ein wichtiges Modell für die Untersuchung komplexer Verhalten aufgrund der Vielzahl von genetischen Werkzeugen zur Verfügung, um Forscher in diesem Bereich. Studieren Bewegungsapparates Verhalten in

Protokoll

Teil 1: Fütterung und Management von Fliegen

1. Fliegen sollte in Flaschen mit hefefrei gängigen Medien kultiviert werden. Sie benötigen eine große Zahl von Fliegen, so kreuzt müssen entsprechend eingestellt werden. Dunkel-Zyklus bei 25 º C: Fliegen sollte in einem 12-Stunden-Licht angebaut werden
2. Fliegen sollte bald nach eclosion gesammelt werden (1-3 Tage). Fliegen können mit in dieser Phase mit einem Kohlendioxid-Diffusor gearbeitet werden, und sollte in Reagenzgläser mit autoklaviert oder Hefe-freien Medien sortiert werden. Wir verwenden nur bei Männern, gespeichert 10 bis ein Reagenzglas.
3. Planen Sie mindestens ein oder zwei Tage nach der Verwendung von Kohlendioxid, bevor Sie die Verhaltensexperimente. Wir betreiben fliegt in unsere Verhaltensweisen Assay 3-5 Tage nach ECLOSION.
4. Assays sollte immer in der gleichen 2-3 Stunden Zeitfenster pro Tag durchgeführt werden, um zirkadianen Rhythmus zu vermeiden.

Teil 2: Einrichten der Tracking-System in einer kontrollierten Umgebung

1. Alle Experimente werden in einer Umgebung, Zimmer, die eine konstante Temperatur von 25 º C mit 70% Luftfeuchtigkeit gewahrt bleibt.
2. Suspend einer digitalen Videokamera über das Gebiet zu erfassen (Kamera nach unten) sein. Da unser Tracking-Software ist hingegen basiert, auszusetzen wir die Kamera über einen Licht-Box. Die Kamera zeichnet Videos direkt auf einem Dell-Computer über eine FireWire-Verbindung. Wir verwenden ein Sharp digitale Videokamera, bis zu einem Dell-Computer mit Windows Moviemaker angeschlossen (Vista-Version) für Video-Akquisition.
3. Air Impulse in diesem Protokoll wird verabreicht werden, so eine Quelle für den Luftstrom vorhanden sein muss in den Raum. Mit Gummi-Schlauch, verbinden die Luft Quelle zu einem Kohlefilter für Luftreinhaltung.
4. Mit mehr Gummischlauch, verbinden Sie die andere Seite der Aktivkohlefilter in einen Erlenmeyerkolben über eine hohle Gummistopfen, und füllen Sie die Flasche mit etwa einem halben Zentimeter Wasser. Dies wird zu befeuchten die Luft.
5. Der Kolben sollte auch eine Waffe, die zu einer Y-förmigen Ventil über Gummischlauch verbindet.
6. Ein Zweig der Y-Ventil sollte ein Durchflussmesser angeschlossen werden. Der andere Zweig sollte die Luft auf den Platz Fortbewegung Kammer zu liefern.

Teil 3: Delivering fliegt in die Fortbewegung Kammer

1. Der Platz Fortbewegung Kammer ist auf die Gestaltung von Wolf et al. 2002 ^1, mit der Zugabe von kleinen Tropfen Schalen, um die Fliegen vom Fliegen in der Kammer zu verhindern. Die Kammer sollte auseinander genommen werden, und alle Komponenten gründlich abgewischt werden mit 70% Ethanol und getrocknet, bevor verwenden.
2. Anästhesie unmittelbar vor der Durchführung einer Verhaltens-Test kann potenziell kompromisslose Leistung. Um dies zu vermeiden, sind Fliegen sanft in die Kammer mit einem Trichter mit einem kleinen Auslauf klopfte. Um eine Steckdose mit der richtigen Größe, legen einen blauen Pipettenspitze (für P1000) bis zum Ende eines Trichters. Mit einer Schere abzuschneiden ganz am Ende der Pipettenspitze, um die Öffnung groß genug für eine Fliege passieren.
3. Die Spitze unserer Kammer ist ein kleines Stück Plexiglas mittels Schrauben an den Rändern befestigt. Wenn die Schrauben entfernt werden, können die Löcher eingesetzt, um Fliegen in die Kammer zu liefern. Positionieren Sie den Plexiglas oben, so dass das Schraubenloch direkt sitzt über der inneren Kammer statt, wo eine Schraube in der Regel sitzt. Nehmen Sie ein Reagenzglas mit dem Fliegen und legen Sie sie kopfüber in den Trichter, die dann in das Schraubenloch platziert werden soll.
4. Bewegen Sie den Trichter, da dies zu verletzen oder Schäden die Fliegen. Stattdessen sanft bang die ganze Kammer, Trichter und alle, bis alle Fliegen in der Kammer sind. Das Klopfen sollte auf einem Mousepad getan werden, um den Schock dieses Klopfen zu absorbieren. Wenn Fliegen drin sind, entfernen Sie den Trichter, und eine neue Position der Plexiglas-top über die Schraube Betten. Dann wieder schrauben Sie die Plexiglas oben einrasten.

Teil 4: Ausführen des Bewegungsapparates Assay

1. Sobald die Fliegen richtig geladen sind, sollen sie in die Kammer für 30 Minuten akklimatisieren. Diese Eingewöhnungszeit sollte in der kontrollierten Umgebung (25 º C, 70% Luftfeuchtigkeit) zu nehmen, und der Kammer sollte auf der Oberseite des Licht-Box platziert werden (das sollte eingeschaltet sein). Schalten Sie anderen Raum Lichter aus.
2. Nach der Eingewöhnungszeit, schalten Sie das Y-Ventil in den Luftstrom so, daß die Luft nur auf das Messgerät fließen. Schalten Sie die Luft, und Rampe die Luft bis die gewünschte Geschwindigkeit (4,0-6,0 L / min). Wir verwenden in der Regel 5,0 bis 5,5 L / min, aber jeder Geschwindigkeit in diesem Bereich arbeiten werden.
3. Sobald die gewünschte Geschwindigkeit erreicht ist, schalten Sie das Y-Ventil, so dass die Luft strömt um die Fortbewegung Kammer. Die Zeit dieser Luft Puls für 15 Sekunden, und dann plötzlich wieder die Luft aus. Wie Sie die Luft auszuschalten, schalten Sie die Kamera im Aufnahme-Modus. (Dieser Teil braucht Übung, um alle auf einmal zu tun).
4. Beenden Sie die Aufnahme nach der gewünschten Zeit und SAVE. Wir erfassen 30 Sekunden Studien bei 10 Frames pro Sekunde (mindestens 8 Versuche pro Genotyp).

Teil 5: Analyse von Videos

1. Wir nutzen dieDynamic Image Analysis System (DIAS) Software 3.2 für ^{Motion-Tracking-2.} Um diese Software nutzen, haben wir zuerst konvertieren unsere Videos in eine AVI-Datei-Format mit Quicktime 7.5.5.
2. So verfolgen die Fliegen an Kontrast basiert, verwenden wir die "Autotrace von Threshold"-Funktion. Wir verwenden dann die "Make-Pfad von Trace"-Funktion zu digitalisieren diese Spuren.
3. Zur Ausgabe der momentanen Geschwindigkeiten der einzelnen fliegen, benutzen wir die "Compute-Parameter"-Funktion, um eine Datenbank-Datei zu erzeugen (DIAS-spezifisch). Mit dieser Funktion haben wir auch glatt die Daten mit Hilfe eines "5,15,60,15,5" Tukey Smoothing-Fenster.
4. Sobald diese Informationen als eine Datenbank-Datei ausgegeben wird, kann es in Microsoft Excel geöffnet werden. Wir verwenden ein Matlab-Skript, um die momentane Geschwindigkeit in Excel erstellen und berechnen zusätzliche Parameter, die zum Verständnis Bewegungsdynamik und Kampf-Struktur.

Repräsentative Ergebnisse:

Abbildung 1 zeigt repräsentative Spuren von Wildtyp Canton S Organismen (Abbildung 1, links) und fliegt null für die dCASK Gen, das durch die Kreuzung zweier großer Überlappung Deletionen (Df (3R) X307 und Df (3R) X313) (Abbildung 1 erzeugt wurden, , rechts). dCASK null Fliegen haben bisher gezeigt, dass Bewegungsapparat Probleme mit Buridans Paradigm ³ haben und in unser Paradigma, im Vergleich zu Canton S, zeigen sie sich sehr Fortbewegung zurück. Wir laufen immer Wildtyp Organismen ersten stellen Sie sicher, dass die Bedingungen und das Verhalten im normalen Bereich an einem bestimmten Tag werden. Wir haben Abweichungen von Standard-Antworten in weniger als 5% des Testens Tagen beobachtet. Diese Unterschiede können in der Regel zu Problemen mit den Parametern unserer kontrollierten Umgebung zugeschrieben werden.

Abbildung 1. DIAS-generated Spuren sowohl Wildtyp Canton S Fliegen (oben, links) und Bewegungsapparat-defizienten dCASK Null fliegt von überlappenden Deletionen (oben rechts) erzeugt. Die Spuren zu repräsentieren, was in den aufgezeichneten Videos gesehen. Beide Bilder kontraindiziert Spuren von 8 bis 10 fliegt für 30 Sekunden in der Video-Tracking-Assay nach einer Luft-Puls.

Abbildung 2. Wildtyp-Fliegen wurden in den Bewegungsapparat Assay (oben) nach einem Luft-Impuls (lila Balken) und ohne Luft-Impuls (blau) ausgeführt werden. In alle Parameter von der Analyse-Programm berechnet, gab es keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Bedingungen (bestimmt mit zweiseitigen Student t-Test). Dies zeigt, dass im Anschluss an eine Luft-Impuls, Fliegen fortbewegen normalerweise in unserer Einrichtung.

Diskussion

In unserer Einrichtung, ein mäßig starkes Luftimpuls vorübergehend stoppt fliegen Bewegung. Wenn die Luft Impuls endet, werden die Fliegen von diesem stationären Zustand und Fortbewegung in der Regel frei, wie in Abbildung 2 dargestellt. Da diese Luft-Impuls effektiv synchronisiert Fortbewegung der Bevölkerung, verwenden wir sie in den Prozess zu beginnen, so dass wir auch studieren können, das Einsetzen der Bewegung nach einem Momentum-breaking Reiz. Der Test kann jedoch ohne Luftimpuls getan werden, da Bewegungsappara...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Quadratische Kammer	Werkzeug	Werkstatt	N/V	Konstruktion nach Wolf et al. 20021
Digitalkamera	Kamera	Sharp	ViewcamZ VL-23
Durchflussmesser	Werkzeug	Cole-Parmer	SY-32003-12
Leuchtkasten	Werkzeug	DNASTAR	Seq-Easy
Aktivkohlefilter	Werkzeug	Fisher Scientific	09-744-37
DIAS 3.2	Software	Soll technologies	N/V	www.solltechnologies.com