Mikroinjektion von Xenopus laevis Oozyten

Zusammenfassung

Hier zeigen wir zytoplasmatische Mikroinjektion Xenopus laevis Eizellen mit einem nuklearen Import Substrat, sowie die Vorbereitung der injizierten Eizellen für die Visualisierung von Dünnschicht-Schnitte Elektronenmikroskopie.

Zusammenfassung

Mikroinjektion von Xenopus laevis Oozyten von Dünnschicht-Schneiden-Elektronenmikroskopie (EM) gefolgt ist ein ausgezeichnetes System für die Untersuchung nukleozytoplasmatischen transportieren. Wegen seiner großen Kern und eine hohe Dichte von Kernporenkomplexe (NPCs), kann Kerntransport leicht sichtbar in der Xenopus-Oozyten. Viel Einblick in die Mechanismen der nuklearen Import und Export ist durch den Einsatz dieses Systems (Bewertung von Pante, 2006) gewonnen. Darüber hinaus haben wir die Mikroinjektion von Xenopus Oozyten verwendet, um die nukleare Import Wege von mehreren Viren, die in der Host-Kern replizieren zu sezieren.

Hier zeigen wir die cytoplasmatische Mikroinjektion von Xenopus Oozyten mit einem nuklearen Import Substrat. Wir zeigen auch, Vorbereitung der injizierten Oozyten für die Visualisierung von Dünnschicht-Schnitte EM, einschließlich Dissektion, Dehydrierung und Einbettung der Eizellen in ein Epoxidharz eingebettet Harz. Schließlich bieten wir repräsentative Ergebnisse für Oozyten, die mit dem Kapsid des Baculovirus Autographa californica Nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) oder Parvovirus Minute Virus of Mice (MVM) wurden mikroinjiziert, und diskutieren mögliche Anwendungen dieser Technik.

Protokoll

Teil 1: Herstellung von Xenopus Oozyten für die Mikroinjektion

1. Legen Sie ein kleines Stück (ca. 2 cm) von Xenopus laevis Ovarien in einem 50-ml konische Röhrchen mit 20 ml Kollagenase-Lösung (5 mg / ml Collagenase in Calcium-freier geändert Barths Kochsalzlösung: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO _4, 10 mM Hepes, pH 7,5). Collagenase wird verwendet, um die Follikelzellen, die die Eizellen umgeben zu entfernen.
2. Das Röhrchen auf einem Schüttler-Plattform und Rock sanft (bei 100 RPM) für eine Stunde. Diese variiert mit verschiedenen Chargen von Kollagenase. So nach einer Stunde, eine kleine Probe von Eizellen und untersu....

Diskussion

Mikroinjektion von Xenopus-Oozyten, Dünn-Schnitte EM kombiniert ist ein hoch effektives Werkzeug für die Untersuchung nukleozytoplasmatischen transportieren. Dieses System wurde verwendet, um verschiedene Schritte der Einfuhr durch die NPC Karte, z. B. Wechselwirkung eines Kernimport Substrat mit strukturellen Komponenten der NPC wie die zytoplasmatische Filamente und nuklearen Korb (Bewertung von Pante, 2006). Es wurde auch verwendet, um die nukleare Import von Atom-replizierende Viren (Pante und Kann, 2002; R.......