Mikroinjektion von Xenopus laevis Oozyten

Summary

Hier zeigen wir zytoplasmatische Mikroinjektion Xenopus laevis Eizellen mit einem nuklearen Import Substrat, sowie die Vorbereitung der injizierten Eizellen für die Visualisierung von Dünnschicht-Schnitte Elektronenmikroskopie.

Abstract

Mikroinjektion von Xenopus laevis Oozyten von Dünnschicht-Schneiden-Elektronenmikroskopie (EM) gefolgt ist ein ausgezeichnetes System für die Untersuchung nukleozytoplasmatischen transportieren. Wegen seiner großen Kern und eine hohe Dichte von Kernporenkomplexe (NPCs), kann Kerntransport leicht sichtbar in der Xenopus-Oozyten. Viel Einblick in die Mechanismen der nuklearen Import und Export ist durch den Einsatz dieses Systems (Bewertung von Pante, 2006) gewonnen. Darüber hinaus haben wir die Mikroinjektion von Xenopus Oozyten verwendet, um die nukleare Import Wege von mehreren Viren, die in der Host-Kern replizieren zu sezieren.

Hier zeigen wir die cytoplasmatische Mikroinjektion von Xenopus Oozyten mit einem nuklearen Import Substrat. Wir zeigen auch, Vorbereitung der injizierten Oozyten für die Visualisierung von Dünnschicht-Schnitte EM, einschließlich Dissektion, Dehydrierung und Einbettung der Eizellen in ein Epoxidharz eingebettet Harz. Schließlich bieten wir repräsentative Ergebnisse für Oozyten, die mit dem Kapsid des Baculovirus Autographa californica Nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) oder Parvovirus Minute Virus of Mice (MVM) wurden mikroinjiziert, und diskutieren mögliche Anwendungen dieser Technik.

Protocol

Teil 1: Herstellung von Xenopus Oozyten für die Mikroinjektion

1. Legen Sie ein kleines Stück (ca. 2 cm) von Xenopus laevis Ovarien in einem 50-ml konische Röhrchen mit 20 ml Kollagenase-Lösung (5 mg / ml Collagenase in Calcium-freier geändert Barths Kochsalzlösung: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO _4, 10 mM Hepes, pH 7,5). Collagenase wird verwendet, um die Follikelzellen, die die Eizellen umgeben zu entfernen.
2. Das Röhrchen auf einem Schüttler-Plattform und Rock sanft (bei 100 RPM) für eine Stunde. Diese variiert mit verschiedenen Chargen von Kollagenase. So nach einer Stunde, eine kleine Probe von Eizellen und untersuchen sie unter einem Binokular. Richtig de-folliculated Eizellen sollten gut voneinander getrennt werden, und es sollte einfach zu einem Glas Nadel in die Eizelle eingefügt werden soll. Wenn die Eizellen nicht ausreichend de-folliculated, sind sie in der Collagenase-Lösung nach links und wieder überprüft alle fünf Minuten.
3. Waschen Sie die Oozyten dreimal mit modifizierten Barths Salzlösung (MBS: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO _4, 0,33 mM Ca (NO _{3) 2,} 0,41 mM CaCl _2, 10 mM Hepes, pH 7,5), und übertragen Sie sie eine 100-mm Durchmesser Petrischale mit MBS plus 1% Penicillin / Streptomycin. Die Eizellen sind nun bereit, mikroinjiziert werden. Wenn Mikroinjektion an einem anderen Tag durchgeführt werden, speichern die Eizellen bei 4 ° C bis zu einer Woche.
4. Mit einem Binokular, wählen Sie reifen Stadium VI Oozyten für die Mikroinjektion. Diese Eizellen sind groß, mit gutem Kontrast zwischen den schwarzen Tier Hemisphäre und die cremefarbenen pflanzlichen Hemisphäre.
5. Übertragen Sie die reifen Stadium VI Oozyten in eine Mikrotiterplatte (Nunc, 10 ul Well-Volumen). Dies sollte sorgfältig durchgeführt werden, mit einem 200-ul-Pipette mit einer Pipettenspitze, die am Ende geschnitten wurde, um ungestört Sog der Eizellen ermöglichen.

Teil 2: Mikroinjektion von Xenopus Oozyten

1. Bereiten Sie die Import-Substrat durch Zugabe einer kleinen Menge von 1% Bromphenolblau, um in der Visualisierung von Mikroinjektion Hilfe mikroinjiziert werden. Zum Beispiel, fügen wir 1 ul Bromphenolblau bis 10 ul Substrat.
2. Setzen Sie einen kleinen Streifen Parafilm auf einer 100-mm-Petrischale, und verzichten einen 5-ul Tropfen der Lösung auf dem Parafilm Streifen injiziert werden.
3. Füllen eines zuvor kalibrierten Injektionsnadel (durch Ziehen eines 6,6-ul Mikropipette Drummond mit dem Inject + Matic Puller) mit der Lösung injiziert werden. Dafür ist die Mikroinjektor auf Aspiration Modus eingestellt. Zur Kalibrierung der Injektionsnadel zu Punkt markiert auf der Nadel alle 0,5 mm, was einem Volumen von 50 nl entsprechen.
4. Für zytoplasmatische Injektion, legen Sie die Spitze der Nadel in eine Eizelle in der pflanzlichen Hemisphäre, sehr nah an das Tier Hemisphäre, bei einem etwa 45-Grad-Winkel. Drehen Sie den Mikroinjektor Einstellung microinject und microinject jeder Eizelle mit 50 nl der Einfuhr Substrat. Der Punkt markiert auf der Nadel werden verwendet, um die Menge an Substrat, das injiziert wurde überwachen.
5. Übertragen Sie die injizierten Oozyten zu einem kleinen (35-mm Durchmesser) Petrischale mit MBS gefüllt und bei Raumtemperatur inkubieren für die gewünschte Zeit (Zeitpunkte sind so die Beobachtung der Import Substrat mit NPCs verbundenen erlauben gewählt; in diesem Fall zwischen 10 und 30 Minuten für Proteine ​​und Viren, die sich aktiv gegen die NPC transportiert werden, dies hängt auch von der Injektionsstelle und die Größe des Proteins / Virus).
6. Nach Ablauf der Inkubationszeit abgeschlossen ist, übertragen Oozyten zu einem 4-ml-Glas-Fläschchen mit 2% Glutaraldehyd in MBS und fix über Nacht bei 4 ° C.

Teil 3: Präparation des Xenopus-Oozyten

1. Am nächsten Tag, waschen Sie die Oozyten 3-mal mit MBS.
2. Transfer-Oozyten zu einer kleinen Petrischale mit wenig Salz-Puffer (LSB: 1 mM KCl, 0,5 mM MgCl _2, 10 mM HEPES, pH 7,5) gefüllt. Mit einem Binokular und Sezieren einer Pinzette entfernen Sie die vegetativen Pol aus jeder Eizelle. Es ist sinnvoll, die Eizelle wird mit einer Pinzette seziert zu stabilisieren, während das andere Paar wie eine Schere benutzt wird, um den vegetativen Pol zu entfernen. An dieser Stelle ist es möglich, den Erfolg der Mikroinjektion durch die Anwesenheit von einem blauen Schimmer in das Cytosol zu bewerten. Das Protokoll ist nur für die Eizellen, die erfolgreich waren mikroinjiziert fortgesetzt. Darüber hinaus, wenn die Proben für die EM vorbereitet sind, macht dieser Schritt Dissektion es viel leichter, den Kern zu finden, wenn Trimmen und Schneiden der Proben.
3. Fix der sezierten Eizellen wieder mit 2% Glutaraldehyd in LSB für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
4. Nach der Fixierung, waschen Sie die seziert Oozyten dreimal mit LSB.

Teil 4: Vorbereitung der injizierten Oozyten für Embedding und Thin-Sectioning EM

1. Übertragen Sie die seziert Eizellen, um eine Depression gleiten. Saugen Sie so viel von der Flüssigkeit wie möglichSible, und dann schnell (so dass sie nicht austrocknen) decken die seziert Eizellen mit 2% niedrig schmelzende Agarose. Während die Agarose noch weich ist, verwenden Sie eine Pipettenspitze, die Eizellen von einander zu trennen und dafür zu sorgen, dass jede Eizelle ist nach oben oder nach unten (nicht seitlich).
2. Lassen Sie die Agarose auf ca. 10 Minuten erstarren. Nachdem die Agarose erstarrt, verwenden Sie eine Rasierklinge, die Agarose in kleine Stücke, die jeweils eine Eizelle seziert geschnitten.
3. Legen Sie die Agarose-embedded Eizellen in einem 4-ml Glasflasche, und post-fix sie mit 1% OsO ₄ in LSB für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
4. Waschen Sie die Probe dreimal in LSB. Falls erforderlich, speichern Sie die Probe bei 4 ° C über Nacht und weiterhin das Protokoll am nächsten Tag.
5. Sequenziell dehydrieren die Proben in eine aufsteigende Reihe von Alkohol (50, 70 und 90% Ethanol für jeweils 20 min). Dies wird durch zwei Änderungen in 100% Ethanol für je 15 min folgte. Schließlich dehydrieren Proben mit 100% Aceton für 15 min.
6. Infiltrate Proben mit einem 1:1-Gemisch aus Epon (Fluka) und Aceton eine Stunde lang, durch Infiltration mit einem 2:1-Gemisch aus Epon und Aceton für 2 Stunden und schließlich in reinem Epon für mindestens sechs Stunden.
7. Ort Proben in flachen Einbettformen mit frischem reinem Epon gefüllt. Die Eizellen werden in so ausgerichtet, dass die Seite des Kerns näher an der Injektionsstelle - in diesem Fall die Seite der Eizellen, die seziert hat - wird im Schnitt zuerst. Dieser Schritt optimiert die Chance der Visualisierung Import der gewählten Substrat.
8. Schließlich polymerisieren die Epon für zwei Tage bei 60 ° C.
9. Um die Proben zu visualisieren, werden die Blöcke geschnitten und dann geschnitten mit einem Ultramikrotom. Die Schnitte werden auf EM-Gitter, gebeizt mit Standard-Verfahren übertragen und visualisiert mit einem Transmissions-Elektronenmikroskop. Wir werden uns nicht zeigen, diesen Teil des Protokolls, wie es Standard-EM Prozedur ist.

Teil 5: Repräsentative Ergebnisse:

Wenn das Protokoll erfolgreich gewesen ist, dann ist die Kernhülle (NE) und NPCs muss deutlich sichtbar in EM-Aufnahmen. Je nach Untergrund injiziert und die Zeit zwischen Injektion und Fixierung, sollte das Substrat sichtbar auf der cytoplasmatischen Seite des NPC, in dem NPC, oder an der Kernenergie angesichts der NPC.

Abbildung 1 zeigt eine NE Querschnitt mit angrenzenden Zytoplasma (c) und Kern (n) aus einer Xenopus-Oozyten, die mit Kapside des Baculovirus AcMNPV injiziert wurde, bei 4 ° C für 4 Stunden und verarbeitet für die Einbettung und Dünnschliff EM wie beschrieben. Pfeilspitzen weisen auf NPCs. Ein Kapsid Andocken an der cytoplasmatischen Gesicht eines NPC ist durch einen weißen Pfeil angezeigt.

Im Gegensatz dazu zeigt Abbildung 2 a NE Querschnitt mit angrenzenden Zytoplasma (c) und Kern (n) aus einer Xenopus-Oozyten, die mit dem Parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), bei Raumtemperatur für 4 Stunden inkubiert injiziert wurde, und verarbeitet zum Einbetten und Dünnschliff EM, wie beschrieben. Mit dieser Technik haben wir festgestellt, dass MVM Störungen des NE (Cohen und Pante, 2005) induziert. Eckige Klammern zeigen Brüche in der NE. Pfeilspitzen weisen auf NPCs. Vermeintliche MVM Kapside mit dem NE verbunden sind durch weiße Pfeile gekennzeichnet.

Abbildung 1: Elektronenmikroskopische Aufnahme eines NE Querschnitt mit angrenzenden Zytoplasma (c) und Kern (n) aus einer Xenopus-Oozyten, die mit Kapside des Baculovirus Ac MNPV injiziert wurde, inkubiert bei 4 ° C für 4 Stunden, und verarbeitet Einbettung und Dünnschliff EM, wie beschrieben. Pfeilspitzen weisen auf NPCs. Kapside sind durch weiße Pfeile gekennzeichnet. Maßstab: 100 nm.

Abbildung 2: Elektronenmikroskopische Aufnahme eines NE Querschnitt mit angrenzenden Zytoplasma (c) und Kern (n) aus einer Xenopus-Oozyten, die mit dem Parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), bei Raumtemperatur für 4 Stunden inkubiert injiziert wurde, und verarbeitet zum Einbetten und Dünnschliff EM, wie beschrieben. Pfeilspitzen weisen auf NPCs. Eckige Klammern zeigen Brüche in der NE. Vermeintliche MVM Kapside mit dem NE verbunden sind durch weiße Pfeile gekennzeichnet. Maßstab: 100 nm.

Discussion

Mikroinjektion von Xenopus-Oozyten, Dünn-Schnitte EM kombiniert ist ein hoch effektives Werkzeug für die Untersuchung nukleozytoplasmatischen transportieren. Dieses System wurde verwendet, um verschiedene Schritte der Einfuhr durch die NPC Karte, z. B. Wechselwirkung eines Kernimport Substrat mit strukturellen Komponenten der NPC wie die zytoplasmatische Filamente und nuklearen Korb (Bewertung von Pante, 2006). Es wurde auch verwendet, um die nukleare Import von Atom-replizierende Viren (Pante und Kann, 2002; R...