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Teil 1: Montieren Sie bauen Gussformen
- Verwenden Sie eine Rasierklinge Silikonschlauch (VWR) zu halbieren und schneiden Sie es in 3 cm lange Stücke schneiden.
- Geben Sie einen Tropfen von Implantat-grade RTV Silikonkleber (Rhodia) auf der Innenseite von jedem Ende des Schlauchs.
- Schnell Ort ein kleines Stück (1 cm x 1 cm) von Polyester-Mesh (McMaster-Carr) auf dem Silikonkleber drop und richten Sie sie mit dem Ende des Schlauchs. Dies wird eine leicht erhöhte und ebene Fläche für Bau Anhang. Wiederholen Sie für das andere Ende.
- Lassen Sie die Form bei Raumtemperatur für 3 Tage trocknen lassen. Es ist hilfreich, 20 bis 30 Formen in einer Zeit zu machen, da diese im Wesentlichen zu entsorgen sind.
- Sobald der Kleber vollständig trocken ist, speichern diese Formen in ein Becherglas mit 70% Ethanol gefüllt, bis sie gebraucht werden. Dieser Schritt wird dazu beitragen, sterilisieren die Formen und das fertige Produkt wird in Abbildung 1 dargestellt.
Teil 2: Vorbereitung für die Myoblasten Zellisolation
- Verdünnen Sie 1 mg Laminin (Sigma) in 250 ml 0,22 um Filter-sterilisierte Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) mit 1% Penicillin / Streptomycin (Invitrogen) und 1% Fungizone (Invitrogen).
- Coat 150 mm Zellkulturplatten (BD Falcon) mit 4 ml der verdünnten Laminin-Lösung aus Schritt 1,1 und bei 37 º C für mindestens 4 Stunden vor dem Ausplattieren der primären Skelettmyoblasten.
- Machen Sie den Myoblasten Medium durch Mischen Hams F-10 Nutrient Mixture (Sigma) mit 20% FBS (Atlanta Biologicals), 5 ng / L basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (Promega), 1% Penicillin / Streptomycin (Invitrogen) und 1% Fungizone ( Invitrogen).
- Bereiten Sie die Skelettmuskulatur Verdauung durch Auflösen von 1 g ~ 295 U / mg Collagenase 2 (Worthington) in 100 ml 2,4 U / ml Dispase-2 (Roche). Add 0,037 g CaCl 2 und gut mischen. Filter sterilisieren die Verdauung Puffer durch einen 0,2 um Filter Festplatte auf eine 10 ml Spritze und speichern Aliquots bei -20 ° C eingebaut Setzen Sie den Betrag für die Gewebe-Verdau bei 37 ° C zusammen mit den Myoblasten Medien benötigt.
Teil 3: Myoblasten isoliert von der Skelettmuskulatur
- Mit einer Pinzette und eine kleine Schere, zu entfernen paraspinalen Muskeln von toten Neugeborenen Lewis Ratten durch Aufschneiden den Rücken hinunter entlang des Rückenmarks, Abziehen der Haut und Faszie Schichten und dann Ausschneiden der Muskeln.
- In einer Gewebekultur Kapuze, platzieren Sie den ausgeschnittenen Muskeln in einem 50 ml konischen Röhrchen (BD Falcon) mit 40 ml 1X Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Invitrogen) auf Eis gefüllt. Lassen Sie den Muskel-Streifen auf den Boden des Röhrchens absetzen und entfernen Sie vorsichtig die meisten der Flüssigkeit und Blut Überreste von Vakuumsauger mit einer sterilen Pasteurpipette in eine Kultur Haube (Baker).
- Gießen Sie die geernteten Muskel Stücke auf einer 150 mm Kulturschale und entfernen Sie so viel von der restlichen Flüssigkeit wie möglich abgesaugt. Mit 2 einseitig geschliffene Klingen zerkleinern das Gewebe zu einer dicken Paste. Gießen vorgewärmten Verdauung Lösung auf der Paste und die Masse in eine frische 50 ml Tube mit einem 10-ml-Pipette. Während der enzymatischen Verdauung, wird das Gewebe gelegentlich verrieben (ohne Blasenbildung) mit einer 10 mL Pipette auf ein schnurloses Pipette-Aid (Drummond) ausgestattet. Auch hier ermöglichen das Gewebe ansiedeln und entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit.
- Das Röhrchen auf einem Schaukelstuhl Plattform und verdauen bei 37 º C für ca. 30 min.
- Sobald der Muskel wird verflüssigt, übergeben Sie die Lösung durch einen 70 um Zellsieb (BD Falcon) und Zentrifuge bei Raumtemperatur für 10 min bei 600 xg (Beckman GP). Mit einer Pasteurpipette und Absaugung, entfernen Sie so viel von der Flüssigkeit wie möglich und das Pellet mit 10 ml warmem Myoblasten Medium.
- Pre-Platte die Zellen auf einer unbeschichteten 150 mm Gewebekulturplatte für 15 Minuten zur Beseitigung von Fibroblasten.
- Übertragen Sie die Zellen, die noch nicht auf die Laminin-beschichtete cultureware befestigt und verdünnen, so dass es eine Platte für jede von 1 bis 2 Rattenbabys. Die Platte wird in einem befeuchteten Inkubator eingestellt bei 37 ° C mit 5% CO 2.
Teil 4: Casting gezüchteten Gewebe-Konstrukten (5 mL)
- Nach 1 bis 2 Tagen, entfernen 10 der 150 mm Myoblasten Zellkulturplatten aus dem Inkubator, spülen Sie sie zweimal mit 37 ° C 1X PBS, und fügen Sie 4 ml warmes 0,05% Trypsin-EDTA auf jeder Platte. Bringen Sie die Platten in den Inkubator für 5 min.
- Ernte der abgelösten Myoblasten aus den Platten in der Kultur Kapuze und sammeln die Flüssigkeit in einer 50 ml Tube (BD Falcon). Verwenden Sie 10 ml Myoblasten mittel-bis alle Platten Spül-und kombinieren diese mit den Zellen in die Zentrifugenröhrchen. Pellet die Zellen bei Raumtemperatur für 10 min bei 600 xg (Beckman GP) und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit wie in Schritt 3.5 beschrieben.
- Resuspendieren Myoblasten Zellen in 1,6 ml Myoblasten Medium und auf Eis stellen.
- Mit einer Pinzette vorsichtig Entfernen 4 konstruieren Formen aus Schritt 1.5 und spülen Sie sie zweimal mit 1X PBS. Vakuum-Sauggreifer aus alle Spuren von PBS mit einer Pasteurpipette, bevor jeder Form in einer 6-well Gewebe culture Platte (BD Falcon).
- Sammeln Sie die anderen Reagenzien für Bau Vorbereitung nötig (10X Hams F10, Antibiotika, Typ-1-Kollagen [3,9 mg / mL] [6] und Matrigel ™) auf Eis und halten Myoblasten bei 37 º C. Kombinieren Sie 500 ul 10x Ham F10, 100 ul Penicillin / Streptomycin, 100 ul Fungizone, 1,6 mL Kollagen, und 750 ul Matrigel ™ in ein konisches 15 ml Tube. Mischen Sie die Lösung für 10 sec mit einem Mini-Vortexer (VWR) auf 10 und auf Eis stellen.
- Anschließend fügen Sie 80 ul von NaHCO 3 und die Myoblasten Suspension aus Schritt 3,3 bis die Mischung aus Schritt 3.5. Vortex die gesamte Mischung für 10 sec und kehren der Röhre in den Eiskübel für ein paar Minuten, um die Lösung von Bläschen klar.
- Vorsichtig warf das Gemisch in die Formen, bevor sie sich verfestigen mit einer 10 ml Pipette beginnt. Jede Form hält ca. 1 mL der viskosen Flüssigkeit. Versuchen Sie zu vermeiden Einführung von Luftblasen während dieses Vorgangs.
- Sorgfältig Übertragung der Teller mit der cast Konstrukte in den Inkubator. Nach ca. 30 min, entfernen Sie die erstarrten Konstrukte aus dem Inkubator und vorsichtig Myoblasten Medium in jede Vertiefung zur Deckung des Gewebes zu konstruieren. Bringen Sie die Platte in den Inkubator (Abbildung 2).
Teil 5: Repräsentative Ergebnisse
Wenn dieses Protokoll korrekt ausgeführt wird, wird die Myoblasten-haltigen Gewebe konstruieren bereit für in vivo-Implantation (dh, wenn aus der Form entfernt) oder für weitere in vitro-Analysen nach 2 Tagen.
Abbildung 1. Beispiele für abgeschlossen zu konstruieren Formen (siehe Schritt 1.5).
Abbildung 2. A verfestigt Myoblasten-haltigen Gewebe konstruieren [1].
Abbildung 3. H & E gefärbten Schnitten eines Myoblasten-haltigen Gewebe zu konstruieren. "A" zeigt einen Längsschnitt und "B" zeigt einen Querschnitt.