Cell Block Vorbereitung von Zytologie Probe mit Vorherrschaft von Individuell verstreuten Zellen

Einleitung:

Dies ist ein Video beschreibt Shidham Methode für Zellenblock Vorbereitung von flüssigen Zytologie (LBC) Probe mit HistoGelTM (Thermo Scientific) (HG). Im Gegensatz zu anderen zufälligen Ansätze verglichen, die folgenden sind die beiden kritischen Merkmale dieses Protokoll für die Vorbereitung Zellblöcke von relativ hypozellulären Proben mit einzeln verstreuten lose Zellen (1-5).

1. Dieses Protokoll umfasst die Schritte, um die Zellen entlang der Ebene parallel zur Schnittfläche der Zelle blockieren konzentrieren.
2. Es enthält auch ein Leuchtturm-wie dunkle Aufnahme von AV-Markierung (Abbildung 1b), die zwei der folgenden Zwecken dient:
   1. Zur Visualisierung der Ebene, auf der die Zellen konzentriert. Die Fläche der Zelle blockieren mit den Zellen von Interesse konnte nun durch die histotechnologist visualisiert werden, wenn die dunkle Leuchtturm während des Schneidens ausgesetzt ist. Diese Fähigkeit zur Überwachung würde man beim Schneiden durch die Ebene mit den meisten der Zellen, oder schneidet nicht zu oberflächlich in die Ebene mit der höchsten Konzentration von Probe-Zellen zu verhindern.
   2. Um als Locator Bezugspunkt in serielle Zellenblock Abschnitt über verschiedene Folien dienen. Dieser Referenzpunkt fungiert als ein Leuchtfeuer zum Auffinden bestimmter Zellen oder Gruppen von Zellen für die Auswertung eines Koordinatensystems Immunreaktivität Muster mit dem SCIP-Ansatz (6,7).

PROTOKOLL (Abbildung 2)

Vorbereitung der Probe.

1. Übertragen Sie die verbleibende LBC Zervixzytologie Probe einen flachen Boden Glasrohr (Durchmesser 15mm x 45mm) (Abb. 2.1 bis 2.4). Legen Sie das Glasrohr in ein größeres Kunststoff Trägerrohr (28 x 85mm) und Zentrifuge. Entfernen Sie den Glasboden Rohr aus dem Trägerrohr und giesst die überstehende.
2. Das Glasrohr wird dann verschlossen (um das Auslaufen von Heizungswasser in den nächsten Schritt zu verhindern) und wieder in eine größere Wohnung unteren Träger Kunststoffrohr gelegt
3. Der Träger Kunststoffrohr mit dem Glasrohr wird dann verschlossen, platziert in einer Zentrifuge (mit schwenkbarem Tassen und nicht festen Winkel Becher so, dass die Zellen senkrecht fallen auf den flachen Boden der Glasröhre), und drehte sich auf 1805 G (3000 rpm, Rotorradius-17cm) für 5 Minuten (Abbildung 2,5).
4. Die Rohre werden dann senkrecht aus der Zentrifuge entfernt und die kleinere Glasröhre ist mit einer Pinzette aus der größeren Träger Kunststoffrohr, ohne die sedimentierte Pellet mit Zellen entfernt.
5. Das Glasrohr mit der Probe ist nicht begrenzten und der Überstand wird dabei nicht auf die flache Schicht von Sedimenten Zellen am Boden (Abb. 2.6) stören gegossen.

Die Einbeziehung der Bezugskoordinatensystem AV-Marker und die Zugabe von Gel-

1. Ein dunkler Leuchtturm AV-Markierung (ca. 2 mm x 2 mm Größe, die Oberfläche flach, Fragment des dunkel gefärbten, sectionable Material) (Abbildung 3) ist als Wegweiser zu dem Glasrohr (Abbildung 2,7) aufgenommen.
2. Verflüssigen ein Aliquot von HG durch Schmelzen in der Mikrowelle für 10 Sekunden bei mittlerer Leistung.
3. 0,5 ml des geschmolzenen HG an das Rohr, vermischen sich mit dem Sediment schnell und rekapitulieren sie (Abb. 2.8) (Fahren Sie mit dem nächsten Schritt schnell, ohne dass die HG zu beginnen Verfestigung).
4. Fügen Sie ca. 2,5 ml warmem (45 ° C) Wasser an den Frachtführer Kunststoffrohr (Abbildung 2,9).
5. Die kleineren capped Glasröhre ist innerhalb der Kunststoffrohr mit warmem Wasser gestellt. (Dieser Schritt ist notwendig, um die HG ein Erstarren in den nächsten Schritten zu halten) (Abbildung 2,9).
6. Der Träger Kunststoffschlauch wird in die Zentrifuge eingesetzt (mit schwenkbarem Tassen und nicht festen Winkel Becher so, dass die Zellen senkrecht fallen auf den flachen Boden der Glasröhre), und drehte sich auf 1805 G (3000 rpm, Rotor-Radius-17cm) für fünf Minuten. Der Zweck dieser Zentrifugation wird der AV-Markierung zu schieben und die Zellen in einer Schicht näher an der Schnittfläche der endgültigen Paraffin eingebetteten Zellen blockieren (Abbildung 1d) zu konzentrieren.
7. Die Rohre werden dann sanft und vertikal aus der Zentrifuge dabei nicht um die sedimentierten dünne Schicht mit der Probe Zellen am Boden stören entfernt.
8. Je größer Kunststoffrohr ist unverschlossen und die kleineren Glasröhre ist vertikal mit einer Pinzette, ohne die Sedimentschicht der Probe Zellen entfernt.
9. Das Glasröhrchen wird gekühlt in vertikaler Position für 15 Minuten zu kühlen und zu verfestigen sich die HG (Abbildung 2.11).

Entfernung von der Zelle blockieren, wie eine Taste des Gels mit Proben für die Endbearbeitung

1. Die verfestigte HG Festplatte, mit der Schicht aus konzentrierten / Sediment Probe an der Unterseite ist aus dem flachen Boden Glasröhre durch spritzende 10% Formalin durch eine 23-Gauge-Nadel mit der Spritze (Abb. 2,12) verdrängt.
2. Die Nadel wird an der Seite des Rohres an der Peripherie des erstarrten HG Scheibe mit Probe (Abbildung 2.12) eingesetzt.
3. Die needle ist an der Seite der Röhre gedreht, während Formalin wird langsam durch die Spritze geschoben. Daraus ergibt sich die Trennung der HG-Taste zusammen mit dunkel gefärbten Beacon AV-Marker und die konzentrierte Probe in sie aus dem flachen Boden des Glasrohres (Abbildung 2.12).
4. Der Zellenblock (Gel-Taste mit Probe-Zellen) wird dann in eine markierte Kassette gelegt und legte für die Gewebe-Verarbeitung in Paraffin eingebetteten Zellen blockiert (Abbildung 2.13) vorzubereiten.

Einbetten und Schneiden der Probe

1. Die Scheibe ist in Paraffin mit dem dunklen Leuchtturm Marker nach unten als Schnittfläche (Abb. 1) eingebettet.
2. Der Block wird bis zum dunklen AV-Markierung geschnitten wie ein Leuchtfeuer ausgesetzt ist und deutlich sichtbar sein.
3. Drei bis vier Mikrometer Abschnitte sind von dieser Ebene die meisten der einzeln verstreuten Zellen aus der Probe enthalten sollte geschnitten.
4. Die Abschnitte werden auf dem Objektträger zur weiteren Färbung, immunhistochemische Färbung oder andere Tests wie angegeben gesammelt. Die Protokolle für diese Tests einschließlich der Art der Folien für die Montage der Teile verwenden können variieren. Generell gilt für Immunfärbung werden beschichtete Folien verwendet werden, um Schwimm-und Verlust von Abschnitten aus den Folien während der Immunfärbung Schritte zu verhindern.

Abkürzungen verwendet werden (in alphabetischer Reihenfolge): CISH, chromogene in situ Hybridisierung Tests; FISH, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung Tests; FFPE, Formalin-fixierten Paraffin eingebetteten, FNA, Feinnadelpunktion; HG, HistoGel ™ (Thermo Scientific); LBC, flüssige Zytologie, PCR Polymerase-Kettenreaktion;

Abbildung 1. Die Struktur der Zelle blockieren, indem Shidham-Protokoll vorbereitet.

Abbildung 2. Die Zusammenfassung der verschiedenen Schritte zur Vorbereitung Zellenblock von LBC Probe durch Shidham-Protokoll.

Abbildung 3. Erstellung von AV-Marker aus Bananenschalen.

Abbildung 4. Vergleich der Zell-Blöcke und Sektionen mit und ohne AV-Marker.

Abbildung 5. Vergleich der Zellstruktur von Teilen der Zelle blockieren mit und ohne AV-Marker.

Cell blocks are a valuable tool for evaluation of various cytology specimens (1). Most importantly, in addition to the architectural details of the specimen, cell blocks allow for evaluation of ancillary studies such as immunocytochemistry, fluorescent/chromogenic in-situ hybridization tests (FISH/CISH) and in-situ PCR. A variety of methods for preparation of cell block are described. However, most of these are suitable for non-gynecologic cytology specimens which contain relatively many cells and with tissue microfragments such as in FNA aspirates and some serous fluids such as effusions (1,3,4,5).

Because cell blocks primarily provide the opportunity for immunocytochemical evaluation, their processing should preferably be similar to that of the formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues. Ultimately the results obtained after immunocytochemical evaluation of cell block sections are compared to those with the published literature performed predominantly on FFPE tissue sections. Any alterations in the protocol potentially compromise and nullify the validity of the results obtained on cell blocks processed through different fixatives and reagent sequences other than that used for routine FFPE. Some commercial techniques may have the drawback of processing through a protocol of exposure to other fixative-reagent exposure.

Various methods of cell block preparation are available for specimens with a significant quantity of sediment and tissue fragments. Principally, the concentrated sediments are supported by some gel or coagulation principle. The maneuverable button is then embedded in paraffin after processing like the surgical pathology specimens/biopsies.

The gels used include gelatin, agar, fibrinogen/plasma-thrombin, and other commercial gels such as HG. The methods of concentration vary from simple pelleting of the sediment by centrifugation to concentration of cells along various types of membranes. Examples include: Milipore, collodin (Celloidin) bags or scraping the cells from the cytology smears on glass slides (1). We also evaluated a variety of gels by trying different combinations of agar and gelatin. None of the combinations achieved the a firm enough consistency to obtain an easily maneuverable disc of solidified gel with embedded cells from the specimen in one piece. HG showed appropriate consistency and in our experience the immunostaining results on HG cell block sections have been excellent.

Liquid based cytology (LBC) specimens for cervicovaginal cytology are generally less cellular than non-gynecologic specimens as mentioned above. In addition, the gynecologic LBC specimens predominantly contain individual scattered exfoliated superficial cells from cervicovaginal mucosa. Due to this, appropriate cellularity within the cell block sections may not be achieved without a special approach. As these singly scattered cellular components in the the block cannot be seen by the histotechnologist during section cutting, the level at which the cells start appearing in the sections cannot be appreciated and may be missed, either by cutting past the level with most cells or not cutting deep enough into the level with highest concentration of sample cells (Figure 4). Shidham’s protocol addresses both of these issues using HG as embedding medium and conventional lab equipments (2) (Figure 2).

This protocol involves following two major features (Figure 1):

1. Concentration and alignment of singly scattered cells in a narrow plane adjacent and parallel to the cutting surface of the cell block (Figure 5).
2. Inclusion of a beacon-like dark AV-marker as a signpost. This is critical for achieving following features:
   1. Identifying and monitoring the level at which the cells are concentrated in the cell block. The exposure of the dark colored signpost highlights the level at which most of the singly scattered cells in the cell block are expected to be located (Figure 4). This prevents the overcutting (cutting past the level with most cells) or undercutting (not cutting deep enough into the level with highest concentration of sample cells) in to the cell block and allow selection of the sections from the level in the cell block corresponding with highest concentration of cells.
   2. The dark colored signpost in the sections also serves as a reference point to survey and identify exactly the same cells in different serial sections of the cell block on different slides (Figure 4). This is critical while interpreting and evaluating the coordinate properties such immunoprofile of particular cells by the SCIP approach to follow the same cells in different sections (6,7).

Although our protocol is standardized and reported for liquid based cervical cytology specimens, it can also be used to enhance diagnostic yield of many other non-gynecologic specimens such as effusion fluids, FNA, brushings, cyst contents etc. In addition the AV marker would facilitate improved application of SCIP approach during immunohistochemical evaluation of cell block sections of these specimens. The embedding medium may be replaced by other reagents with appropriate modifications at relevant steps. HG may be replaced by plasma (Fibrinogen) to be gelled by Thrombin at room temperature (1).