Primäre Kulturen von Aplysia Senso-motorischen Neuronen ein Modell Vorbereitung auf das Studium Synapsenbildung und synaptische Plastizität In-vitro-. Dieses Video zeigt die Identifikation und Mikrodissektion der sensorischen und motorischen Neuronen aus Aplysia Ganglien sowie die Methoden zur Festlegung und Aufrechterhaltung senso-motorischen Neuronen in Kultur.
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Methodenartikel
Vorbereitung der Aplysia Sensory-Motor neuronalen Zellkulturen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das Nervensystem der Meeresschnecke Aplysia californica ist relativ einfach, bestehend aus etwa 20.000 Neuronen. Die Neuronen sind groß (bis zu 1 mm im Durchmesser) und identifizierbar sind, mit unterschiedlichen Größen, Formen, Positionen und Pigmentierungen, und die Zellkörper nach außen in fünf gepaart Ganglien im ganzen Körper des Tieres verteilt ausgesetzt. Diese Eigenschaften haben die Forscher um die Schaltung zugrunde liegenden spezifischen Verhaltensweisen in der Tier 1 abzugrenzen erlaubt. Die monosynaptische Verbindung zwischen sensorischen und motorischen Neuronen ist ein zentraler Bestandteil der Kiemenrückziehreflex in das Tier, eine einfache Abwehrreflex in dem das Tier zieht ihren Kiemen in Reaktion auf taktile Stimulation des Siphons. Dieser Reflex erfährt Formen des nicht-assoziativen und assoziativen Lernens, einschließlich der Sensibilisierung, Gewöhnung und klassische Konditionierung. Von besonderem Nutzen für das Studium der synaptischen Plastizität kann der sensorisch-motorischen Synapse in der Kultur wieder hergestellt werden, wo gut charakterisierten Reize zu entlocken Formen der Plastizität, die direkt korreliert in das Verhalten des Tieres 2,3 haben. Speziell erzeugt Anwendung von Serotonin eine synaptische Verstärkung, dass, abhängig von der Anwendung Protokoll, dauert Minuten (kurzfristige Erleichterung), Stunden (mittelfristige Erleichterung) oder Tagen (langfristige Erleichterung). Im Gegensatz dazu erzeugt die Anwendung der Peptid-Sender FMRFamid eine synaptische Schwächung oder Depression, die, abhängig von der Anwendung Protokoll von Minuten bis Tage (long-term depression) dauern kann. Die Größe der Neuronen ermöglicht wiederholte scharfe Elektrode Aufnahme der synaptischen Erregung über Zeiträume von Tagen zusammen mit Mikroinjektion von Expressionsvektoren, siRNAs und andere Verbindungen auf spezifische Signalwege und Moleküle Ziel und damit die molekularen und zellbiologischen Schritte, die Änderungen unterliegen in der synaptischen Effizienz.
Ein weiterer Vorteil der Aplysia Kultur-System kommt von der Tatsache, dass die Neuronen Synapsen-Spezifität zeigen, in der Kultur 4,5. So müssen sensorischen Neuronen nicht bilden Synapsen mit sich selbst (autapses) oder mit anderen sensorischen Neuronen, noch bilden sie Synapsen mit Nicht-Zielorganismen identifiziert Motoneuronen in der Kultur. Die Krampfadern, Stätten der synaptischen Kontakte zwischen sensorischen und motorischen Neuronen, sind groß genug (2-7 Mikrometer im Durchmesser), damit Synapsenbildung (sowie Veränderungen der synaptischen Morphologie) mit Ziel-Motoneuronen auf das Licht mikroskopischer Ebene untersucht werden.
In diesem Video zeigen wir jeden Schritt der Herstellung sensorisch-motorischen Neurons Kulturen, einschließlich Anästhesie erwachsenen und jugendlichen Aplysia, sezieren ihre Ganglien, Proteaseverdau der Ganglien, die Entfernung des Bindegewebes durch Mikrodissektion, Identifizierung der beiden sensorischen und motorischen Neuronen und Entfernung jeder Zelltyp durch Mikrodissektion, dem Plattieren der Motoneuronen, neben der sensorischen Neuronen und Manipulation der sensorischen Neuriten Kontakt mit dem kultivierten Motoneuronen bilden.
Protokoll
Vorbereitung (siehe Lösungen Abschnitt am Ende des Protokolls für die Zusammensetzung von Lösungen)
- Bereiten Kulturschalen. Beschichtung von Glas und von Mattek Glasboden-Kulturschale mit Poly-L-Lysin (made in Natriumborat). Add genug, um vollständig zu bedecken das Glas gut und lassen für> 1 Std. (über Nacht bleiben). Gründlich von Poly-L-Lysin durch Spülen in künstlichem Meerwasser (ASW) 4-5 mal. Nach dem Entfernen der letzten Spülgang, fügen Sie 2 ml 50% L15 (ergänzt mit Salzen und mit L-Glutamin in einer Endkonzentration von 2 mM) / 50% Hämolymphe. Das Kulturmedium muss in Schale für mindestens eine Stunde vor dem Beschichten Zellen, so dass die Hämoly....
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Diskussion
Die erfolgreiche Herstellung von Aplysia sensomotorische Kulturen hat eine etwas langsame Lernkurve, da es die Entwicklung der Feinmotorik mit Mikrodissektion und Manipulation einzelner Nervenzellen über ein Stereo-Mikroskop betrachtet verbundenen beinhaltet. Nach unserer Erfahrung dauert es ca. 1-3 Wochen Praxis zu gesunden isolierten sensorischen Neuronen in Kultur und eine zusätzliche 1-3 Wochen erhalten zu lernen, wie sensorische Neuronen mit motorischen Neuronen Paar. Wir routinemäßig vorzubereiten Kulture.......
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Danksagungen
Die Arbeit im Labor mit der Kultivierung von Aplysia ist nach Liste NIH R01 und NIH R21MH077921 finanziert.
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Materialien
Lösungen benötigt für die Kultur
- 0,35 M MgCl 2, bei Raumtemperatur gelagert, verwendet für die Anästhesie.
- Poly-L-Lysin-Lösung, Sigma: P-1524, MW> 300.000, in 0,1 M Natrium-Borat pH8.2 bis 0,5-Promillegrenze Lösung gemacht. Vortex gut und filtriert durch ein 0,22 um Filter zu sterilisieren, lagern Sie es bei 4C °. Nicht Frost-Tau.
- L-15 Medium-Pulver (Leibovitz) (Sigma: L4386) mit den Salzen, wie unten zu 1 Liter ergänzt
Add ddH20 auf 1 Liter. Der pH-Wert sollte ca. 7,4-7,5 werden, fügen Sie 10 ml 100X Pen / Strep-Lösung und durch einen 0,22 m Filter Filter-sterilisiert. Lagerung bei 4C0 nicht länger als 1 Monat.L-15-Pulver 13.8g NaCl 15,4 g D-Glucose 6,24 g MgSO 4 7H 2 0 6.45g KCl 350 mg NaHCO 3 170 mg MgCl 2 6H 2 O 5,49 g CaCl 2 · 2H 2 O 1.43g HEPES 3.53g - Proteaseverdau Lösung: 1% Protease IX (1unit/mg) ist in L15 gemacht (ergänzt mit Salzen wie oben) oder in ASW unmittelbar vor dem Gebrauch, durch einen 0,22 m Millipore-Filter-sterilisiert. 5mls sollte genug für den Ganglien von zwei Tieren (sicherstellen, dass die Ganglien vollständig in Protease-Lösung getaucht). Sigma hat berichtet, dass sie einzustellen Verkauf Protease IX. Ein Ersatz-Protease ist: Dispase II (Roche Applied Science Katalog # 04942078001).
- Kulturmedium. Unmittelbar vor der Vorbereitung Kulturen, Tauwetter ein 10 ml Aliquot Hämolymphe und mischen Sie es mit 10 ml L15 (ergänzt mit Salzen wie oben), um 20mls Kulturmedium zu machen. Add 200 ul 200 mM L-Glutamin, gut mischen und Verwendung zur Herstellung von Kulturen. Dieses Medium sollte frisch zubereitet jedes Mal Kulturen gemacht werden.
- Künstlichem Meerwasser kann von Instant Ocean (Aquarium Systems, Mentor, OH) oder wie folgt vorgenommen werden: 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 30 mM MgCl 2 (6H 2 O), 20 mM MgSO 4, 10 mM CaCl 2 (2H 2 O), 10 mM HEPES, mit pH-Wert eingestellt auf 7,4.
Referenzen
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Rayport, S. G., Schacher, S. Synaptic plasticity in vitro: cell culture of identified ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
