In diesem Video stellen wir Ihnen die Ex vivo Erzeugung und Erweiterung des menschlichen CD40-aktivierten B-Zellen (CD40-B) aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) durch Stimulation mit CD40-Ligand und Interleukin-4.
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Methodenartikel
Generation of Human CD40-aktivierten B-Zellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
CD40-aktivierte B-Zellen (CD40-B-Zellen) wurden als eine alternative Quelle für immunstimulierende Antigen-präsentierende Zellen (APC) für die Immuntherapie von Krebs 3.1 identifiziert worden. Im Vergleich zu Dendritische Zellen (DCs), den am besten charakterisierten APC, CD40-B-Zellen haben mehrere verschiedene biologische und technische Eigenschaften. Ähnlich wie DCs, B-Zellen eine erhöhte Expression von MHC-und kostimulatorischen Molekülen (Abb. 1b) zeigen, weisen eine starke Wanderungsbewegungen Kapazität und präsentieren Antigen-Präsentation effizient auf T-Zellen nach Stimulation mit Interleukin-4 und CD40-Ligand (CD40L). Doch im Gegensatz zu unreifen oder reifen DCs, Express-CD40-B-Zellen die volle Lymphknoten Homing Triade bestehend aus CD62L, CCR7/CXCR4 und Leukozyten-Antigen-Funktion-1 (LFA1, CD11a/CD18), die für Homing zu sekundären lymphatischen Organen (Abb. 1a) 3. CD40-B-Zellen können ohne Schwierigkeiten aus sehr geringen Mengen im peripheren Blut, die weiter in vitro werden, um sehr große Mengen an hochreinen CD40-B-Zellen (> 10 9 Zellen pro Patient) von gesunden Spendern sowie Krebs kann erweitert erzeugt werden Patienten (Fig.1c, d) 1,4.
In diesem Protokoll haben wir demonstrieren, wie voll aktiviert CD40-B-Zellen aus humanen PBMC erhalten. Key-Moleküle für die Zellkultur sind CD40-Ligand, Interleukin-4 (IL-4) und Cyclosporin A (CsA), die in einer 3-4 Tage alten Kultur-Zyklus wieder aufgefüllt werden. Für Laborzwecke CD40-Stimulation wird durch NIH/3T3-Zellen exprimierenden rekombinanten humanen CD40-Liganden (tCD40L NIH/3T3) 5 zur Verfügung gestellt. Zur Vermeidung von Kontaminationen mit nicht-transfizierten Zellen ist die Expression des humanen CD40-Liganden auf die Transfektanten regelmäßig überprüft werden (Abb.2).
Nach 14 Tagen CD40-B-Zell-Kulturen bestehen aus mehr als 95% reinen B-Zellen sowie eine Ausweitung des CD40-B-Zellen über 65 Tage ist oft möglich, ohne Verlust der Funktion 1, 4. CD40-B-Zellen effizient aufnehmen, verarbeiten und präsentieren Antigene an T Zellen 6. Sie haben nicht nur prime naϊve, sondern auch zu erweitern Memory T-Zellen 7,8. CD40-aktivierte B-Zellen können verwendet werden, um B-Zell-Aktivierung, Differenzierung und Funktion zu untersuchen. Darüber hinaus stellen sie ein vielversprechendes Werkzeug für therapeutische oder präventive Impfung gegen Tumoren 9.
Protokoll
Das Protokoll für die Erzeugung von menschlichen CD40-aktivierte B-Zellen aus PBMC ist in zwei Teile gegliedert: Teil A zeigt die Herstellung von CD40-Liganden exprimieren NIH/3T3-Zellen, die als Platten-gebundenen Feeder-Zellen verwendet werden. Teil B beschreibt die eigentliche CD40-B Kultur.
A. Herstellung von Feeder-Zellen (tCD40L NIH/3T3)
Die tCD40L NIH/3T3 ist ein Anhänger murine Fibroblasten-Zelllinie, die nie sollte vollständig konfluent. Die Zellen sind daher zweimal pro Woche aufgeteilt. Die Kultivierung von mehr als 6 Wochen wird nicht empfohlen.
- Entfernen Sie alte Medium aus dem Primär-Kultur mit einer sterilen Pipette und waschen Sie die Zellen mit 10 ml 1x PBS. Saugen Sie das PBS nach dem Waschen.
- 4 mL Trypsin / EDTA in einer 75 cm 2-Kolben für 5-10 Minuten bei 37 ° C. Verwenden leichtes Klopfen auf die Zellen zu lösen.
- Fügen Sie 10 ml Wildtyp-mittel-und Schwenk-sanft.
- Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 50 ml-Tube mit einer sterilen Pipette und drehen Sie die Zellen nach unten bei 225 xg für 5 min.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 10 ml Wildtyp-Medium. Zählen Sie die Zellzahl eines Aliquots der Zellsuspension und bereiten drei 50 ml-Röhrchen mit der entsprechenden Anzahl von Zellen:
- 1,5 x 10 6 Zellen zur Subkultivierung
- 0,2 x 10 6 Zellen / well für die Bestrahlung von CD40-B-Zell-Kultur verwendet
- Rest einfrieren (falls erforderlich).
- Drehen Sie die Zellen nach unten bei 225 xg für 5 min.
- Entfernen Sie den Überstand.
- Für Subkultivierung: resuspendieren 1,5 x 10 6 Zellen in 10 mL Wildtyp-Medium in einem 75 cm 2 Zellkulturflasche (Zelldichte 1,5 x 10 5 Zellen / ml), fügen G-418 [0,7 mg / mL] und inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2. Split die Zellen zweimal pro Woche.
- Für die CD40-B-Zell-Kultur: Sie müssen 1,2 x 10 6 Zellen für eine 6-Well-Platte. Resuspendieren der Zellen in Wildtyp-Medium mit einer Dichte von 0,1 x 10 6 Zellen / ml und bestrahlen sie bei 78 Gy. Plate 2 mL der Zellsuspension in jede Vertiefung und inkubieren sie bei 37 ° C mit 5% CO 2. Mit diesem vorbereiteten Platten für B-Zell-Stimulation, wenn tCD40L NIH/3T3-Zellen Anhänger sind (mindestens 4 Stunden: check Einhaltung mit dem Mikroskop; warten Sie nicht länger als 24 h auf B-Zell-Stimulation beginnen). (Fahren Sie mit B.)
B. CD 40-B-Zell-Kultur
I. Vorbereitung der PBMCs für CD40-Stimulation (Tag 0):
Bitte beachten Sie: Bevor Sie fortfahren vergewissern, dass Feeder-Zellen adhärent sind. Fügen Sie immer frische Lösungen von Interleukin-4 und Cyclosporin A, um das Wachstum mittelfristig unmittelbar vor dem Gebrauch.
- Nehmen PBMCs, entweder frisch oder in geeigneter Weise aufgetaut. Resuspendieren PBMCs zweimal in 50 ml 1x PBS zu waschen und Spin-down ersten Mal bei 265 xg für 7 min und ein zweites Mal bei 190 xg für 7 min zu anderen Zellen zu entfernen. Überstand verwerfen und die Zellen in 20 ml PBS. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen in einem Aliquot der Zellsuspension.
- Spin down benötigte Menge an Zellen bei 225 xg für 5 min. Für eine 6-Well-Platte 4 x 10 6 Zellen / well benötigt werden, also 24 x 10 6 Zellen pro Platte.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die PBMC mit 1 x 10 6 Zellen / ml in CD40-B Kulturmedium frisch mit 50 U / ml Interleukin-4 ergänzt als Wachstumsfaktor und 0,63 ug / ml Cyclosporin A Auswuchs der T-Zellen zu verhindern (Angesichts Konzentrationen beziehen sich auf ein ml Kulturmedium!).
- Entfernen Sie den Überstand aus 6-Well-Platte vorinkubiert mit tCD40L NIH/3T3-Zellen.
- Waschen Sie die Anhänger tCD40L NIH/3T3-Zellen mit 2 mL PBS pro Vertiefung ersten und in einem zweiten Schritt mit 2 ml CD40-B Waschmedium.
- Vorsichtig 4 ml PBMC Suspension (1 x 10 6 Zellen / ml) in jede Vertiefung der 6-Well-Platte.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2.
- Am Tag 7 reculture der Zellen (Fahren Sie mit 3.2.).
II. Rekultivierung von CD40-B-Zellen (Tag 7 und dann alle 3-4 Tage):
- Ernte-Clustern von CD40-B-Zellen aus 6-Well-Platte durch Resuspendieren mit einer 10 mL Pipette und sie gemeinsam in eine 50 ml Tube.
- Spin down bei 225 xg für 7 Minuten und vollständig ersetzen den Überstand mit CD40-B Waschmedium. Während des Zählens der Zelle Betrag eines aliquoten, drehen Sie das Zellen nach unten bei 225 xg für 5 Minuten. Resuspendieren CD40-B-Zellen in CD40-B Kulturmedium in einer Konzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml.
- Fügen Sie frische Lösungen von Interleukin-4 in einer Konzentration von 50 U / ml und 0,63 pg / mL Cyclosporin A auf das Medium.
- Entfernen Sie den Überstand aus einer 6-well-Platte mit tCD40L NIH/3T3-Zellen vorinkubiert.
- Waschen Sie die adhärenten Zellen mit 2 ml PBS pro Vertiefung ersten und in einem zweiten Schritt mit 2 ml CD40-B Waschmedium.
- vorsichtig 4 ml (1 x 10 6 Zellen / ml) von CD40-B Suspension in jede Vertiefung der 6-Well-Platte.
- Die Platten bei 37 ° C mit 5% CO 2.
- Subculture Zellen wieder alle 3-4 Tage bis zum Ende mit hochreinem humanen CD40-aktivierte B-Zellen nach insgesamt 14 Tagen.
C. Trouble-Shooting - Was passiert, wenn CD40-B-Zellen nicht wachsen?
- Haben Sie überprüft, für die CD40-Ligand Expression von Feeder-Zellen?
- Die Platte gebundene Nährzellen der Stimulation dürfen nicht älter 24 Stunden?
- Ist eine Kontamination mit Mykoplasmen möglich?
- War der Interleukin-4-Lösung zur Ergänzung eingesetzt frisch aufgetaut und hatte die entsprechende biologische Aktivität?
- War Cyclosporin A aufgenommen in der richtigen Konzentration?
Abbildung 1. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version der Abbildung 1.
Abbildung 2. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version der Abbildung 2 dargestellt.
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Materialien
A. Herstellung der Medien:
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Feeder Zelle Wildtyp-Medium | Feeder Zelle Selektionsmedium | ||
| Reagens | Konzentration | Reagens | Konzentration |
| DMEM-Ham / F12 | DMEM-Ham / F12 | ||
| L-Glutamin | 365 pg / mL | L-Glutamin | 365 pg / mL |
| FBS | 10% | FBS | 10% |
| HEPES | 10 mM | HEPES | 10 mM |
| Gentamycin | 15 ug / mL | Gentamycin | 15 ug / mL |
| G-418 | 0,7 mg / mL | ||
| CD40-B Waschmedium | CD40-B Kulturmedium | ||
|---|---|---|---|
| Reagens | Konzentration | Reagens | Konzentration |
| IMDM | IMDM | ||
| L-Glutamin | 584 pg / mL | L-Glutamin | 584 pg / mL |
| HEPES | 25 mM | HEPES | 25 mM |
| Gentamycin | 15 ug / mL | Gentamycin | 15 ug / mL |
| rh Transferrin | 50 ug / mL | ||
| rh Insulin | 5 ug / mL | ||
| AB-Humanserum | 10% | ||
B. Sonstige Reagenzien:
| Reagens | Firma | Bestell-Nr |
|---|---|---|
| DMEM / Ham 's F12 | PAA | Cat No: E15-813 |
| IMDM | Invitrogen Gibco ® | REF 21980-032 |
| Dulbecco PBS (10x) | PAA | Cat No H15-011 |
| AB-Humanserum | Invitrogen | Cat No 34005100 |
| Holo-Transferrin menschlichen | Sigma | Cat No T0665 |
| Insulin human | Sigma | Cat No I2643 |
| Gencin ® | Delta Select | Art.-Nr. 7395800 |
| Rekombinanten humanen Interleukin-4 | Immunotools | Cat No 11130045 |
| Cyclosporin A | Novartis | Cat No NDC 0078-0109-01 |
| FBS | LONZA | Cat No DE14-802C |
| HEPES-Puffer | PAA | Cat No S11-001 |
| G-418 Sulfat | PAA | Cat No P02-012 |
| Trypsin / EDTA (10x) | Invitrogen Gibco ® | REF 15400-054 |
C. Sonstiges Zubehör:
| Reagens | Firma | Bestell-Nr |
|---|---|---|
| Sterile Pipettenspitzen | Sarstedt | |
| 6-Well-Platte | NUNC | Cat No 140675 |
| 50 ml konischen Rohr | BD Falcon ™ | Cat No 352070 |
| Zellkulturflasche | SARSTEDT | Cat No 83.1813.002 |
Referenzen
- Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100, 2757-2765 (1997).
- Schultze, J. L., Grabbe, S., vonBergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25, 659-664 (2004).
- Bergwelt-Baildon, M. von CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107, 2786-2789 (2006).
- Wiesner, M. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 3, 1464-14 (2008).
- Urashima, M., Chauhan, D., Uchiyama, H., Freeman, G. J., Anderson, K. C. CD40 ligand triggered interleukin-6 secretion in multiple myeloma. Blood. 85, 1903-1912 (1995).
- Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63, 2836-2843 (2003).
- von Bergwelt-Baildon, M. S. Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99, 3319-3325 (2002).
- Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155, 249-256 (2009).
- Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15, 955-965 (2008).
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