Wir beschreiben einen In vivo Fluoreszenz-Imaging-Protokoll, um die Regeneration der Muskulatur von GFP-markierten Myoblasten Monitor nach der Transplantation in der Skelettmuskulatur von gesunden und dystrophischen Mäusen. Dieses Protokoll kann angepasst an die Regeneration der Muskulatur durch die Transplantation von anderen Arten von Zellen und in anderen Muskelerkrankungen sowie zu studieren.
Methodenartikel
Tracking-Dynamics of Muscle Engraftment bei Kleintieren durch In Vivo Fluorescent Imaging
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Muskeldystrophien sind eine Gruppe von degenerativen Muskel-Erkrankungen, die durch fortschreitenden Verlust der kontraktilen Zellen gekennzeichnet. Derzeit gibt es keine kurative Behandlung nicht möglich. Jüngste Fortschritte in der Stammzellbiologie haben neue Hoffnungen für die Entwicklung wirksamer Therapien Zelle erzeugt werden, um diese Krankheiten zu behandeln. Transplantation von verschiedenen Arten von Stammzellen mit fluoreszierenden Proteine in Muskeln der dystrophischen Tiermodellen beschriftet wurde weitgehend in das Feld verwendet. Eine nicht-invasive Technik mit der Möglichkeit, die transplantierten Zellen Schicksal track längs können weiter unsere Fähigkeit, Muskel-Transplantation von transplantierten Zellen genauer und effizienter zu bewerten.
In der vorliegenden Studie zeigen wir, dass in vivo Fluoreszenz-Imaging ist eine sensible und zuverlässige Methode für die Verfolgung von transplantierten GFP (Green Fluorescent Protein)-markierten Zellen in Maus Skelettmuskeln. Trotz der Besorgnis über die Hintergründe durch die Verwendung eines externen Licht notwendig für die Anregung des fluoreszierenden Proteins, fanden wir, dass, indem Sie entweder Nacktmaus oder Beseitigung Haar mit Haarentfernung Reagenzien viel von diesem Problem beseitigt ist. Mit einer CCD-Kamera, kann das Fluoreszenzsignal in den Tibialis anterior (TA) Muskel nach der Injektion von 5 x 10 5 Zellen entweder von GFP transgenen Mäusen oder eGFP transduziert Myoblasten Kultur erkannt werden. Für weitere oberflächliche Muskeln wie dem M. extensor digitorum longus (EDL), Injektion von weniger Zellen produziert ein nachweisbares Signal. Signalintensität gemessen und quantifiziert werden, da die Anzahl der emittierten Photonen pro Sekunde in einer region of interest (ROI). Da die aufgenommenen Bilder klare Grenzen zur Abgrenzung der transplantierten Bereich zeigen, kann die Größe der ROI sowie gemessen werden. Wenn die Beine konsequent jedes Mal positioniert sind, spiegeln die Veränderungen in der Gesamtzahl der Photonen pro Sekunde pro Muskelgruppe und die Größe der ROI die Änderungen in der Zahl der transplantierten Zellen und die Größe des eingepflanzten Bereich. Die Veränderungen in den gleichen Muskel im Laufe der Zeit sind quantifizierbar. In vivo Fluoreszenz-Imaging-Technik wurde in erster Linie auf das Wachstum von Zellen tumorogene Spur verwendet, unsere Studie zeigt, dass es ein mächtiges Werkzeug, das uns ermöglicht, das Schicksal der transplantierten Stammzellen Weg ist.
Protokoll
Zellpräparation
- Satellite Zellisolation
- Unter Narkose werden die Beinmuskeln der GFP transgenen Mäusen (C57BL / Ka-βactin-EGFP) entfernt. Nach dem Schneiden in kleine Stücke, sind Satelliten-Zellen enzymatisch gespalten durch Inkubation des zerkleinerten Gewebes mit 2% Dispase Kollagenase-Lösung für 1 Stunde bei 37 ° C.
- Neutralisieren das Enzym die Verdauung mit einem Wachstum Medien mit Ham F-10 und 20% FBS, distanzieren den Muskel durch wiederholtes Verreiben mit einer Pasteurpipette. Die Zellen werden durch eine Zelle Sieb (ø70-100 um) filtriert und dann auf einem nicht-beschichteten Teller für 1 Stunde bei 37 ° C beschichtet
- Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und die Platte sie auf einer Kollagen-beschichtete Schale. Wiederholen Sie diesen Schritt 1 Stunde später an die Myoblasten zu reinigen. (Pre-Platte)
- Ändern Sie den Medien-und Platte die Zellen in der Zeit. Die endgültige Reinigung Myoblasten werden in Medium mit Ham F-10, 20% FBS, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin (Wachstumsmedium) bei 37 ° C mit 5% CO2, 95% Luft kultiviert.
- Kultur und erweitern Sie den primären Myoblasten in Wachstumsmedium mit Zugabe basischer FGF von 10 ng / ml.
- Für alle die in-vivo-Experimente, spritzen wir 5x10 5 Zellen pro TA Muskel.
- Bei der Ernte die Myoblasten, lösen wir die Zellen mit 0,25% Trypsin / EDTA und waschen Sie sie mit PBS zweimal. Die Zellzahlen sind mit einer Zählkammer gezählt und die Zellen in HBSS bei einer Konzentration von 5x10 4 Zellen / ul resuspendiert. Die konzentrierte Zellen in HBSS auf Eis gestellt und injiziert innerhalb von 1 Stunde nach der Entnahme.
In Vivo Imaging
- Männlich mdx-Mäusen im Alter von 4-6 Wochen aus Jackson Labor gekauft und bei einem Tier Wohnanlage.
- Nach ca. 1 Woche Unterkunft für die Umwelt, werden die Mäuse bereit, mit den kultivierten Zellen implantiert werden.
- Vor-Transplantation ist die Maus durch eine intraperitoneale (ip) Injektion der Mischung von Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) narkotisiert. Dann werden die Haare um den TA Muskel-Bereich wird durch die Anwendung Nair, um das Bein und wartet 30 Sekunden, um wischen Sie sie mit destilliertem Wasser reinigen entfernt.
- Während sich die Maus noch in Narkose, sind 5x10 5 Zellen in 10 &mgr; l HBSS langsam in jeder TA Muskel an 3 Punkten mit einem 30-Gauge-Nadel injiziert.
- Nach Schritt 4, kann die Maus regelmäßig durch in vivo Fluoreszenz-Imaging abgebildet werden. Die Fluoreszenz-Imaging-Station Nightowl LB981 (Berthold Technologies, Inc.) mit einer hochempfindlichen CCD-Kamera ausgestattet, wird verwendet, um Bilder aus dem behindern Beine der Mäuse zu erhalten.
- Am Tag des In-vivo-Bildgebung, überprüfen wir zunächst die das Nachwachsen der Haare auf dem TA Muskel. Wenn nötig, werden wir erneut bewerben Nair, um das Haar, wie oben beschrieben zu entfernen, nachdem Anästhesie der Maus mit der Mischung aus Ketamin und Xylazin.
- Während sich die Maus in Narkose legen wir die Maus in Bauchlage auf einem Stück schwarzen, nicht fluoreszierendem Papier (schwarz Artagain Papier aus Strathmore). Um vollständig aussetzen TA Muskel für eine bessere Bildgebung, tape wir die Hinterpfoten, um das Papier.
- Wir platzieren Sie den Mauszeiger in der Imaging-Kammer und die Position der Hinterbeine, um in der Mitte des Sichtfeldes der Kamera abgebildet werden. Wir ersten Schalter aus dem Emissions-Filter zu einem traditionellen Graustufen-Foto-Bild des Beines mit einer Belichtungszeit von 5 Sekunden dauern. Danach ist die Position der Maus und Fokus der Kamera, wenn nötig. Die Imaging-Parameter einschließlich Belichtungszeit (1.250 ms), Probenhöhe (0,9 cm) etc. konstant gehalten werden in der experimentellen Verfahren.
- Wir haben dann in die entsprechende Emission Filter-Schalter für das grün fluoreszierende Protein Wellenlänge. Wir nehmen Fluoreszenzbild mit einer Belichtungszeit von 1.250 ms und einem Binning-Zahl von 1. Nach der Belichtung wird die Maus aus dem Imaging-Kammer auf einen Käfig, um Erholung zu warten entfernt.
- Für die Analyse erstellen wir eine Region of Interest (ROI) über die Fluoreszenz-Signale ihrer Intensität in Bezug auf die Photonen pro Sekunde zu messen. Wir messen auch die Größe der ROI in Bezug auf die Anzahl der Pixel als eine weitere Quantifizierung Wert. Die Imaging-Experimente können jede Woche wiederholt werden oder häufiger über ein paar Monate, falls erforderlich, Längsschnittdaten zu erwerben.
Am Ende der Experimente wird die Maus getötet und das TA Muskel ist für die Histologie Analyse geerntet.
Diskussion
Wir haben eine zuverlässige und stabile Imaging-Plattform für die Verfolgung der fluoreszenzmarkierten transplantierten Zellen in Host Skelettmuskulatur in dieser Studie. GFP-markierten Myoblasten aus GFP transgenen Maus steht für einen Typ von adulten Stammzellen, die Kandidaten für die Zelltherapie in der Zukunft sein wird. Eine ständige Manipulation einschließlich Zellzahl, Zell-Injektion, klaren Hintergrund, Bildposition und Maschinen-Parameter ist für die Gewinnung hochwertiger Bild-und vor allem für die quantitative Analyse wichtig.
Fluoreszenz-Bildgebung hat viele Anwendungen in der biomedizinischen Forschung, wie sie nicht-invasiv, einfach zu bedienen ist, und hat einen hohen Durchsatz. Neben Fluoreszenz-Bildgebung kann eine quantitative Messung der Photonen, obwohl aufgrund der Streuung, Dämpfung und Absorption basiert bereitzustellen, kann Licht nicht durchdringen einen großen Abstand im Gewebe, die einen Mangel der Technik ist. Es wurden Anstrengungen im Gange, um Rot-oder Nah-Infrarot-Reporter nutzen, um die Eindringtiefe des Lichts zu erhöhen.
Ein weiterer Vorteil der Fluoreszenz-Bildgebung ist, dass es übersetzbar Kliniken ist, wenn die spezifischen fluoreszierenden Reporter für den menschlichen Gebrauch zugelassen ist. Im Vergleich mit MRT, CT und PET, hat Fluoreszenz-Bildgebung eine hohe Flexibilität, da sie nicht teure Hardware-und Imaging-Agenten. Ein Beispiel hierfür ist Fluoreszenz-basierten Endoskop und Mikro-Endoskop, das in Kliniken verwendet wurden. Durch die Kombination von Fluoreszenz-Imaging mit anderen Modalitäten, erwarten wir die Fähigkeit, sowohl anatomische und funktionelle Informationen über die zugrunde liegenden biologischen Prozesse erwerben zu erreichen.
Danksagungen
Die Arbeit der Z-und Y-Yang Wang wurde möglich durch Gewährung K02 AR051181 aus NIAMS / NIH, Zuschüsse aus Muscular Dystrophy Association und Harvard Stem Cell Institute for Y Wang. Die Arbeit von Q Zeng und X Xu sind durch ein Programm Zuschuss für das Optical Imaging Lab aus dem Brigham and Women Hospital unterstützt. Die Autoren bedanken sich bei Wen Liu aus der Abteilung für Anästhesie, BWH, danke für die technische Hilfe in der Zelle arbeiten.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| NightOwl LB981 | Berthold Technologies |
Referenzen
- Ballou, B., Ernst, L. A., Waggoner, A. S. Fluorescence imaging of tumors in vivo. Curr Med Chem. 12, 795-805 (2005).
- Green, fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Godavarty, A., Sevick-Muraca, E. M., Eppstein, M. J. Three-dimensional fluorescence lifetime tomography. Med Phys. 32, 992-1000 (2005).
- Graves, E. E., Weissleder, R., Ntziachristos, V. Fluorescence molecular imaging of small animal tumor models. Curr Mol Med. 4, 419-430 (2004).
- Graves, E. E., Yessayan, D., Turner, G., Weissleder, R., Ntziachristos, V. Validation of in vivo fluorochrome concentrations measured using fluorescence molecular tomography. J Biomed Opt. 10, 44019-44 (2005).
- Gurfinkel, M., Ke, S., Wen, X., Li, C., Sevick-Muraca, E. M. Near-infrared fluorescence optical imaging and tomography. Dis Markers. , 107-121 Forthcoming.
- Lee, J., Sevick-Muraca, E. M. Three-dimensional fluorescence enhanced optical tomography using referenced frequency-domain photon migration measurements at emission and excitation wavelengths. J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis. 19, 759-771 (2002).
- In vivo fluorescence imaging of muscle regeneration by transplanted eGFP-labeled myoblasts. Xu, X., Yang, Z., Liu, Q., Wang, Y. Annual Meeting of American Society of Gene Therapy, 2008 May 28-June 1, Boston, Ma, , American Society of Gene & Cell Therapy. Milwaukee, WI. (1985).
- Hoffman, R. M. In vivo cell biology of cancer cells visualized with fluorescent proteins. Curr Top Dev Biol. 70, 121-144 (2005).
- Coulton, G. R., Morgan, J. E., Partridge, T. A., Sloper, J. C. The mdx mouse skeletal muscle myopathy: I. A histological, morphometric and biochemical investigation. Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 53-70 (1988).
- Morgan, J. E., Partridge, T. A. Muscle satellite cells. Int J Biochem Cell Biol. 35, 1151-116 (2003).
- Mendell, J. R., Kissel, J. T., Amato, A. A., King, W., Signore, L., Prior, T. W., Sahenk, Z., Benson, S., McAndrew, P. E., Rice, R. Myoblast transfer in the treatment of Duchenne's muscular dystrophy. N Engl J Med. 333, 832-838 (1995).
- Bogdanovich, S., Perkins, K. J., Krag, T. O., Khurana, T. S. Therapeutics for Duchenne muscular dystrophy: current approaches and future directions. J Mol Med. 82, 102-115 (2004).
- Morgan, J. E., Coulton, G. R., Partridge, T. A. Mdx muscle grafts retain the mdx phenotype in normal hosts. Muscle Nerve. 12, 401-409 (1989).
- Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L., Wagers, A. J. Determinants of skeletal muscle contributions from circulating cells, bone marrow cells, and hematopoietic stem cells. Stem Cells. 22, 1292-1304 (2004).
- Cerletti, M., Jurga, S., Witczak, C. A., Hirshman, M. F., Shadrach, J. L., Goodyear, L. J., Wagers, A. J. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134, 37-47 (2008).
Nachdrucke und Genehmigungen
