Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae</em

Zusammenfassung

Beschreibung eines quantitativen Phosphorylierung Verfahren mit cryolysis, Harnstoff solubilziation, HILIC Fraktionierung und IMAC Anreicherung von phosphorylierten Peptiden.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt das Wachstum und die Anregung, mit der Fettsäure Oleat, der isotopisch schweren und leichten S. cerevisiae-Zellen. Die Zellen werden unter Verwendung einer cryolysis Verfahren in einer Kugelmühle Mühle und die daraus resultierenden grindate in Lösung von Harnstoff Solubilisierung gebracht. Dieses Verfahren ermöglicht die Lyse der Zellen in eine metabolisch inaktiven Zustand, Erhaltung Phosphorylierung und verhindert Neuausrichtung der Phosphoproteom während der Zelllyse. Nach der Reduktion, Alkylierung, Trypsinverdauung der Proteine ​​werden die Proben auf C18-Säulen und die Probe Komplexität durch Fraktionierung unter Verwendung von hydrophilen Interaktionschromatographie (HILIC) reduziert entsalzt. HILIC Säulen bevorzugt behalten hydrophile Moleküle, die gut für phosphoproteomics geeignet ist. Phosphorylierte Peptide neigen dazu, später eluieren in der chromatographische Profil als die nicht phosphorylierte Pendants. Nach der Fraktionierung sind Phosphopeptide angereichert mit immobilisierten Metall-Chromatographie, die gegen Gebühr-basierte Affinitäten für Phosphopeptid Bereicherung beruht. Am Ende dieses Verfahrens werden die Proben bereit, quantitativ durch Massenspektrometrie analysiert werden.

Protokoll

Das Wachstum der Zellen und Medien

1. Eine einzelne Kolonie von BY4742Δarg4Δlys1 Zellen über Nacht in 100 mL Rich Media zu einer OD ₆₀₀ von 1,0 dann Samen in zwei 1-Liter-Kulturen eine minimale Hefemedium (0,17% Yeast Nitrogen Base ohne Ammoniumsulfat oder Aminosäuren, 0,5% Ammoniumsulfat) mit einem volle Ergänzung von Aminosäuren, mit 20 mg / L von isotopisch normalen oder schweren Arginin ergänzt ⁽¹³ C ₆ ¹⁵ N _4; Isotec) und Lysin ⁽¹³ C ₆ ¹⁵ N _2; Isotec).
2. Die Zellen wurden für 18 Stunden gewachsen, auf eine OD ₆₀₀ von 1,8. Es ist w....

Diskussion

Diese Methode wird zu einer Bereicherung der Phosphopeptide quantitativ analysiert werden kann. Eine Reihe von Parametern können in diesem Protokoll verändert werden, aber der wichtigste Aspekt zu erinnern ist, Ihre Phosphorylierung zu bewahren. Vorbereitung der Zellen für die Quantifizierung kann in einer Reihe von verschiedenen Wegen erreicht werden, zum Beispiel, wenn Sie nicht Etikett Ihre Zellen in vivo, tags wie ICAT [3] oder iTRAC [4] kann nach der Extraktion verwendet werden, um differentiell Label zwei.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Isotec™ L-Arginin-13C6,15N4	Sigma-Aldrich	608033
Isotec™ L-Lysin-15N2	Sigma-Aldrich	609021
GIBCO™ Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 7,4 (10X), flüssig	Invitrogen	70011044
SigmaFAST Protease-Inhibitor-Tabletten	Sigma-Aldrich	S8820
Pierce Halt Phosphatase-Inhibitor-Cocktail	Thermo Fisher Scientific, Inc.	78420
Retsch PM100 Kugelmühle	Retsch	20.540.0001
Retsch 125 ml Mahlbecher aus Edelstahl	Retsch	01.462.0148
Ultramicrospin C18-Säule	The Nest Group	SUM SS10
Sep-Pak Vac 500 mg C18	Waters	WAT043395
TSK-Gel Amide-80 4,6 mm x 25 cm Analysensäule	Tosoh Corp.	13071	Dies ist die HILIC-Chromatographiesäule.
Schutzsäule 4,6 mm Innendurchmesser x 1 cm	Tosoh Corp.	19021	Wir empfehlen diese Schutzsäule, um die Lebensdauer Ihrer HILIC-Säule zu verlängern.
PHOS-Select™ Eisen-Affinitäts-Gel	Sigma-Aldrich	P9740	Dies ist das IMAC-Harz. Portionieren und lagern.