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Methodenartikel

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

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DOI:

10.3791/1474

⸱

12. Oktober 2009

 , 
1Institute for Systems Biology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Beschreibung eines quantitativen Phosphorylierung Verfahren mit cryolysis, Harnstoff solubilziation, HILIC Fraktionierung und IMAC Anreicherung von phosphorylierten Peptiden.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt das Wachstum und die Anregung, mit der Fettsäure Oleat, der isotopisch schweren und leichten S. cerevisiae-Zellen. Die Zellen werden unter Verwendung einer cryolysis Verfahren in einer Kugelmühle Mühle und die daraus resultierenden grindate in Lösung von Harnstoff Solubilisierung gebracht. Dieses Verfahren ermöglicht die Lyse der Zellen in eine metabolisch inaktiven Zustand, Erhaltung Phosphorylierung und verhindert Neuausrichtung der Phosphoproteom während der Zelllyse. Nach der Reduktion, Alkylierung, Trypsinverdauung der Proteine ​​werden die Proben auf C18-Säulen und die Probe Komplexität durch Fraktionierung unter Verwendung von hydrophilen Interaktionschromatographie (HILIC) reduziert entsalzt. HILIC Säulen bevorzugt behalten hydrophile Moleküle, die gut für phosphoproteomics geeignet ist. Phosphorylierte Peptide neigen dazu, später eluieren in der chromatographische Profil als die nicht phosphorylierte Pendants. Nach der Fraktionierung sind Phosphopeptide angereichert mit immobilisierten Metall-Chromatographie, die gegen Gebühr-basierte Affinitäten für Phosphopeptid Bereicherung beruht. Am Ende dieses Verfahrens werden die Proben bereit, quantitativ durch Massenspektrometrie analysiert werden.

Protokoll

Das Wachstum der Zellen und Medien

  1. Eine einzelne Kolonie von BY4742Δarg4Δlys1 Zellen über Nacht in 100 mL Rich Media zu einer OD 600 von 1,0 dann Samen in zwei 1-Liter-Kulturen eine minimale Hefemedium (0,17% Yeast Nitrogen Base ohne Ammoniumsulfat oder Aminosäuren, 0,5% Ammoniumsulfat) mit einem volle Ergänzung von Aminosäuren, mit 20 mg / L von isotopisch normalen oder schweren Arginin ergänzt (13 C 6 15 N 4; Isotec) und Lysin (13 C 6 15 N 2; Isotec).
  2. Die Zellen wurden für 18 Stunden gewachsen, auf eine OD 600 von 1,8. Es ist wichtig, dass die Zellen durch mindestens 9 Generationen gehen auf volle Einbindung der markierten Isotope zu erreichen. Das Licht Probe wurde pelletiert, gewaschen mit sterilem Wasser, reseeded in ein Oleat Medium (isotopisch normalen Arginin und Lysin, 0,2% Oleate (Sigma Chemicals) und 0,5% Tween 40 (Sigma Chemicals)) und stimuliert für weitere 85 Minuten. Daraus ergibt sich eine isotopisch leichte, im Hinblick auf Arginin und Lysin, Probe und einem isotopisch schwere Glukose-grown Referenzprobe Oleat-stimulierte.

Cell Lysis, Isolierung und Fraktionierung von Peptiden

  1. Wiegen Zentrifugenflasche. Ernte Proben durch Zentrifugation für 3 Minuten. Entfernen Sie das Medium und saugen überschüssige Flüssigkeit. Wiegen Sie Pellet und Flasche (in der Regel zwischen 1-2 Gramm Ausbeute) blinken dann in flüssigem Stickstoff einfrieren. Fügen Sie ein Volumen entspricht der Pellet-Gewicht von "Schleifen" Puffer, um die gefrorenen Pellets in flüssigem Stickstoff (Phosphate Buffered Saline (PBS, Gibco), 10% Glycerin, Protease-Inhibitoren (SigmaFAST Protease Inhibitor Tabletten, Sigma) und HALT Phosphatase-Inhibitoren (Thermo Scientific )).
  2. Einfrieren der Mahlbehälter in flüssigem Stickstoff. Warten Sie, bis der flüssige Stickstoff nicht mehr kochen. Übertragen Sie die Pellets zum Schleifen Schiff mit gefrorenem Kugellager.
  3. Grind bei 600 Umdrehungen pro Minute mit einer 1 min 20 sec-Zyklus mit einer Richtungsumkehr für 3 Minuten. Wieder einfrieren der Mahlbehälter in flüssigem Stickstoff. Wiederholen Sie die 4 mal 15 Minuten insgesamt Mahldauer.
  4. Sammeln Sie die gefrorenen grindate in ein 50ml Falcon-Röhrchen statt Trockeneis. Bei -80 ° C bis zur Verwendung.
  5. Machen Sie eine 10ml Lösung von 8 M Harnstoff, 0,1 M Ammoniumhydrogencarbonat, 0,1 M Tris pH 8,6. Add 3 Bände der Harnstoff-Puffer auf 1 Volumen des eingefrorenen grindate (zum Beispiel 3mls der Harnstoff-Puffer hinzugefügt, um einen 1 Gramm Pellet mit 1 ml PBS-Puffer). Unmittelbar beschallen die Mischung mit einer Sondenspitze Sonicator (2 bis 10 Sekunden-Takt). Halten Sie die Spitze in der Nähe der Boden des Röhrchens zu verhindern Schaumbildung. Die grindate sollte sofort in Lösung gehen.
  6. Deaktivieren Sie das Lysat durch Zentrifugation für 5 Minuten bei 4 ° C.
  7. Überstand in frische Röhrchen.
  8. Machen Sie ein frisches Aliquot von 0,5 M Tris [2-carboxy] phosphin (TCEP). In den Probe bei 1:100 für einen 5mm Endkonzentration. Bei 37 ° C für 1 h.
  9. Alkylierung von reduzierten Cysteinen. Lassen Sie sich auf Raumtemperatur abkühlen. Machen Sie eine frische Aliquot 1M iodoacetamide. Halten Sie in der Dunkelheit (wir wickeln das Rohr in Folie). Hinzufügen, um eine Endkonzentration von 20 mM. Inkubieren im Dunkeln für 1 h bei Raumtemperatur.
  10. Quench der iodoacetamide mit 20 mM DTT aus einer 1M Lager bei Raumtemperatur für 1 h.
  11. Quantifizierung des Proteins mit einem Standard-Bradford oder BCA-Assay (nicht beschrieben). Nehmen Sie eine Probe für die Analyse durch SDS-PAGE unten.
  12. Zur Validierung Einbeziehung der schweren Isotope, verwenden Sie 100 ul des reduzierten und alkylierten Lysat. Verdünnen 1:4 mit dH 2 O, beschallen und fügen Trypsin bei 50:1 Protein Trypsin. Digest für ein Minimum von 4 Stunden, trockenen Probe in einem Speed ​​Vac und dann entsalzt mit einem C18 Ultramicrospin Spalten (The Nest Group).
    1. Hydrate Spalte mit 100 ul Acetonitril
    2. Äquilibrieren mit 200 ul 0,1% TFA.
    3. Resuspendieren trockenen Probe in 200 ul 0,1% TFA. Legen Sie auf Spalte. Zentrifuge bei ~ 200 xg oder die minimale Geschwindigkeit für den Durchfluss durch die Säule benötigt.
    4. Zweimal waschen mit 200 ul 0,1% TFA.
    5. Elution mit zweimal mit 50 ul 60% Acetonitril, 0,1% TFA.
    6. Dry Probe in einem Speed ​​Vac.
    7. Resuspendieren Probe in 20 ul 0,1% Ameisensäure. Run 2 ul auf einem Massenspektrometer. Überprüfen Einbeziehung von isotopisch schwere Arginin und Lysin durch eine 10 und 8 Dalton Verschiebung der jeweiligen m / z-Spektren. 98% - Die Aufnahme für jede Aminosäure sollte zwischen 96 sein.
  13. Mix äquivalenten Mengen (mg Protein) des isotopisch schweren und leichten Proben.
  14. Verdünnte Probe 1:4 mit 20% Methanol.
  15. Add Trypsin bei 1:200. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C.
  16. Prüfen Sie, ob die Verdauung hat bis zur Fertigstellung durch SDS-PAGE gegangen. Run 2 und 4 ul der Vorverdauung Probe und 8 eind 16 ul der post Trypsin zu verdauen. Visualisieren Sie durch Coomassie-Färbung, die die Verdauung abgeschlossen ist. Wenn es nicht abgeschlossen ist, beschallen die Probe mit einer Sondenspitze Sonicator kurz und zu verdauen wieder mit Trypsin.
  17. Trocknen Sie die Probe in einem Speed ​​Vac. Nach dem Trocknen mit 200 ul der gefilterten dH 2 O und Wirbel bis das Pellet in Lösung geht. Dry Probe in einem Speed ​​Vac. Resuspendieren wieder mit dH 2 O. Dry Probe wieder.
  18. Pellet in 0,1% Trifluoressigsäure (TFA; Sigma). Prüfen Sie, ob der pH-Wert um 3 ist mit pH-Streifen. Wenn säuern mit 10% TFA benötigt.
  19. Pellet aus jedem Niederschlag.
  20. Desalt die Proben auf einem Waters Sep-Pak Vac 500 mg C18-Säule. Überlasten Sie nicht diese Spalten. Die maximale Menge beträgt 5 mg, aber es ist besser, Last ein bisschen weniger. Teilen Sie die Probe zwischen mehreren Spalten, wenn nötig.
    1. Hydrate die Säule mit 5 ml 100% Acetonitril. Zentrifuge bei ~ 200 xg oder die minimale Geschwindigkeit für den Durchfluss durch die Säule benötigt.
    2. Äquilibrieren Säule mit 5 ml 0,1% TFA. Laden Probe. Sammeln Sie Vor-und Last wieder.
    3. Waschen mit 5 ml 0,1% TFA. Wiederholen.
    4. Elution mit 2 ml 60% Acetonitril, 0,1% TFA.
    5. Dry Probe in einem Speed ​​Vac.

Peptide Fraktionierung und Isolierung von Phosphopeptide

  1. Peptide sind fraktionierte auf HILIC. Wir verwenden eine TOSOH TSK-Gel Amide-80 4,6 mm x 25 cm analytischen Säule mit einer Vorsäule. Nehmen Sie sich Zeit mit diesem Schritt führen Sie die Spalte für 2 Stunden bei 90% A führen Sie dann zwei leere Steigungen vor dem Laden Ihrer Probe. Die maximale Belastung auf einer Säule dieser Größe gedacht, um XX ist, wir in der Regel nicht geladen mehr als 5 mg pro Lauf.
  2. Solvent A - 98% ACN/0.1% TFA
    Solvent B - 2% ACN/0.1% TFA
    Legen Sie in 90% A über 20 ', 90% A bis 85% A über 5', 85% A bis 60% A über 40 ', 60% A auf 0% A über 5', 0% A bis 90% A über 5 '.
  3. Der Durchfluss wird 1ml/min und Fraktionen wurden in 2 Minuten Abständen gesammelt beginnend mit dem 85% A bis 60% A-Gradienten.
  4. Kombinieren Fraktionen, die Zahl der Fraktionen auf 10 zu reduzieren. Erhöhte Fraktionen wird wahrscheinlich ergeben eine größere Abdeckung des Phosphoproteom.

Anreicherung von Phosphopeptide

  1. Phosphopeptide angereichert mit PHOS-Select Eisen Affinity Gel. Wir aliquoten unsere IMAC Harz zu vermeiden, wiederholte Einfrieren und Auftauen. Machen Sie 50 ml eines 250 mM Essigsäure, 30% ACN Last Lösung. Bringen Sie den pH-Wert auf 2,7 mit HCl. Resuspendieren Pellets in 500 ul der Last Lösung. Überprüfen pH, passen mit HCl oder NaOH als notwendig.
  2. Vorwäsche 200 ul IMAC Perlen in einer entsprechenden Spalte. Wir verwenden Molbiotec Spin-Säulen.
    Add 15 ul einer 50%-Aufschlämmung (Gel zur Lösung Last) zu jeder Fraktion, und inkubieren Sie die Proben für 30 'mit Ende über Ende Rotation. Halten Sie den Fluss für die Analyse.
  3. Wash Proben 3 mal mit Last-Lösung und einmal mit 500 ul gefiltert dH 2 O.
  4. Eluieren Peptide mit 2 bis 3 min mit 400 ul 50 mM Na 2 HPO 4 (pH 8,4) Puffer. Transfer in ein Glasgefäß.
  5. Angesäuert auf pH 3 mit 5 ul 100% ige Ameisensäure, Flash-Freeze in flüssigem Stickstoff und getrocknete Probe in einem Speed ​​Vac.
  6. Resuspendieren Phosphopeptide in 200 ul 0,1% TFA und C18 sauber wie oben beschrieben. Dry unten eluierten Proben in einem Speed ​​Vac.
  7. Resuspendieren Peptide in 20 ul 0,1% iger Ameisensäure. Verwenden Sie 2 ul pro Massenspektrometer-Analyse oder nach Bedarf.

Hinweise

Für viel von diesem Protokoll Sie arbeiten werden "blind". Die Zell-Lyse kann durch Western-Blot und Bradford oder BCA-Assays und die Trypsinverdauung kann auch leicht beurteilt werden überwacht werden. Die HILIC wird gab eine Spur ähnlich wie diese, oder wie von anderen [1, 2] in Abhängigkeit von der Flüssigchromatographie Maschine, wird gesehen. Die Proben werden mittels Massenspektrometrie überwacht; testen Sie Ihre Proben auf kostengünstigen Maschinen wie LCQs oder Maldis, bevor er zu den hohen Kosten-Analysen auf einem hohen Masse Genauigkeit, hohe Auflösung Maschine. Schließlich, wenn Sie eine Trocknung bis eine Probe mit Säure in ihm, aus Glas verwenden.

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Diskussion

Diese Methode wird zu einer Bereicherung der Phosphopeptide quantitativ analysiert werden kann. Eine Reihe von Parametern können in diesem Protokoll verändert werden, aber der wichtigste Aspekt zu erinnern ist, Ihre Phosphorylierung zu bewahren. Vorbereitung der Zellen für die Quantifizierung kann in einer Reihe von verschiedenen Wegen erreicht werden, zum Beispiel, wenn Sie nicht Etikett Ihre Zellen in vivo, tags wie ICAT [3] oder iTRAC [4] kann nach der Extraktion verwendet werden, um differentiell Label zwei...

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Danksagungen

Wir möchten Dr. Rich Rogers für die technische Unterstützung danken, mit der Massenspektrometrie analysiert und hilfreiche Diskussionen und Drs. Rob Moritz, Jeff Ranish und Hamid Mirzai für hilfreiche Diskussionen.

Diese Arbeit wurde durch die NIH Centers of Excellence finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Isotec™ L-Arginin-13C6,15N4Sigma-Aldrich608033
Isotec™ L-Lysin-15N2Sigma-Aldrich609021
GIBCO™ Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 7,4 (10X), flüssigInvitrogen70011044
SigmaFAST Protease-Inhibitor-TablettenSigma-AldrichS8820
Pierce Halt Phosphatase-Inhibitor-CocktailThermo Fisher Scientific, Inc.78420
Retsch PM100 KugelmühleRetsch20.540.0001
Retsch 125 ml Mahlbecher aus EdelstahlRetsch01.462.0148
Ultramicrospin C18-SäuleThe Nest GroupSUM SS10
Sep-Pak Vac 500 mg C18WatersWAT043395
TSK-Gel Amide-80 4,6 mm x 25 cm AnalysensäuleTosoh Corp.13071Dies ist die HILIC-Chromatographiesäule.
Schutzsäule 4,6 mm Innendurchmesser x 1 cmTosoh Corp.19021Wir empfehlen diese Schutzsäule, um die Lebensdauer Ihrer HILIC-Säule zu verlängern.
PHOS-Select™ Eisen-Affinitäts-GelSigma-AldrichP9740Dies ist das IMAC-Harz. Portionieren und lagern.

Referenzen

  1. Albuquerque, C. P. A multidimensional chromatography technology for in-depth phosphoproteome analysis. Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1389-1396 (2008).
  2. McNulty, D. E., Annan, R. S. Hydrophilic interaction chromatography reduces the complexity of the phosphoproteome and improves global phosphopeptide isolation and detection. Mol Cell Proteomics. 7 (5), 971-980 (2008).
  3. Gygi, S. P. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotechnol. 17 (10), 994-999 (1999).
  4. Ross, P. L. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  5. Gruhler, A. Quantitative phosphoproteomics applied to the yeast pheromone signaling pathway. Mol Cell Proteomics. 4 (3), 310-327 (2005).
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  7. Villen, J., Gygi, S. P. The SCX/IMAC enrichment approach for global phosphorylation analysis by mass spectrometry. Nat Protoc. 3 (10), 1630-1638 (2008).
  8. Jensen, S. S., Larsen, M. R. Evaluation of the impact of some experimental procedures on different phosphopeptide enrichment techniques. Rapid Commun Mass Spectrom. 21 (22), 3635-3645 (2007).
  9. Larsen, M. R. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Mol Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).
  10. Pinkse, M. W. Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns. Anal Chem. 76 (14), 3935-3943 (2004).
  11. Tao, W. A. Quantitative phosphoproteome analysis using a dendrimer conjugation chemistry and tandem mass spectrometry. Nat Methods. 2 (8), 591-598 (2005).
  12. Zhou, H., Watts, J. D., Aebersold, R. A systematic approach to the analysis of protein phosphorylation. Nat Biotechnol. 19 (4), 375-378 (2001).
  13. Bodenmiller, B. Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome. Nat Methods. 4 (3), 231-237 (2007).

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Schlagwörter

HefezellenOleat StimulationKryolyse VerfahrenHarnstoff Solubilisierunghydrophile Interaktionschromatographieimmobilisierte Metallaffinit tschromatographieMassenspektrometrieisotopische MarkierungPeptidfraktionierung
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