Summary
Нейтрофилов внеклеточной ловушки (сети) являются важным механизмом врожденного иммунитета для борьбы патогенных бактерий, грибков и паразитов. Здесь мы опишем методы, чтобы изолировать нейтрофильных гранулоцитов из крови человека и активировать их, чтобы сформировать NET. Мы представляем подготовку методов для визуализации сетей в световой и электронной микроскопии.
Abstract
Нейтрофильные гранулоциты являются наиболее распространенными группа лейкоцитов в периферической крови. Как профессиональные фагоциты, они поглощают бактерии и убивают их внутриклеточно, когда их антимикробной предохранитель гранулы с фагосомы. Мы обнаружили, что нейтрофилы имеют дополнительный способ убить микроорганизмы: после активации, они выпускают гранулы белков и хроматина, которые вместе образуют внеклеточные волокна, которые связывают патогенов. Эти новые структуры или нейтрофилов внеклеточной Ловушки (НРТ), ухудшают факторов вирулентности и убивают бактерии, 1, 2 грибков и паразитов, 3. Структурные основы сетей является ДНК, и они быстро разлагается в присутствии DNases. Таким образом, бактерии выражения DNases, более опасны, 4. Использование корреляционного микроскопию TEM объединения, SEM, иммунофлюоресценции и жить методы ячейка изображения, мы могли бы показать, что при стимуляции ядер нейтрофилов теряют свою форму и ес-и гетерохроматин гомогенизации. Позже, ядерной оболочки и мембраны гранулы распадаются позволяет смешивание NET компонентов. Наконец, сетки выпущен как перерывы клеточной мембраны. Эта программа гибели клеток (NETosis) отличается от апоптоза и некроза и зависит от поколения активных форм кислорода NADPH оксидазы 5.
Нейтрофилов внеклеточной ловушки в изобилии на сайтах острого воспаления. НРТ-видимому, форма врожденного иммунного ответа, которые связывают микроорганизмы, предотвратить их распространение, а также обеспечить высокие локальные концентрации антимикробных препаратов деградировать факторов вирулентности и убивать патогенные что позволяет нейтрофилов выполнять свои функции антимикробных даже за пределами их жизни. Существует все больше доказательств, однако, что НРТ также участвуют в заболеваниях, которые варьируются от аутоиммунных синдромов к бесплодию 6.
Мы опишем методы, чтобы изолировать нейтрофильных гранулоцитов из периферической крови человека 7 и стимулировать их к созданию NET. Также включают в себя протоколы для визуализации сетей в световой и электронной микроскопии.
Protocol
1. ПМН изоляции от человеческой крови
Используйте около 24 мл крови человека с ЭДТА или гепарин (10 ЕД / мл) в качестве антикоагулянта.
- Добавить 6 мл Histopaque 1119 по 15 мл трубки Сокол и тщательно слоя от 5 до 7 мл цельной крови на вершине.
- Центрифуга в течение 20 минут при 800 мкг без торможения.
- Аспирацию и отбросить желтоватый и ясный верхний слой и нижний красновато передачи фазы, содержащей гранулоцитов на свежий труб Falcon.
- Вымойте клетки, заполняя Сокол труб с PBS и центрифуги в течение 10 минут при 300 х г.
- В то же время подготовить 100% Перколла решение путем смешивания 18 мл Перколла с 2 мл 10х PBS. С 1x PBS подготовить 4 мл растворов 85%, 80%, 75%, 70% и 65% Перколла.
- Подготовка 2 Сокол трубки с градиентом Перколла отводками 2 мл каждый процент друг на друга в порядке убывания.
- После центрифугирования супернатант удалить, объединить окатышей и ресуспендирования осажденных клеток в 4 мл PBS.
- Тщательно слой 2 мл ресуспендирования на каждое из градиентов.
- Центрифуга в течение 20 минут при 800 мкг без торможения.
- После центрифугирования удалить верхний слой, и большинство из 65%-слой с МНПК и собирать белый оставшиеся интерфаз до 85% слоя в новые трубы Falcon.
- Вымойте клетки, заполняя Сокол труб с PBS и центрифуги в течение 10 минут при 300 х г.
- Удалить супернатант и ресуспендируйте осажденных клеток (обычно> 95% PMN) в 2 мл PBS.
- Граф клеток с использованием гемоцитометра.
2. Активация PMNs
- Подготовка 24-клеточной культуре также пластины, поставив стерильные 13 мм круглый скольжения покровного стекла (# 1,5) в каждую лунку
- Семенной 2 х 10 5 клеток в 500 мкл RPMI (содержащих 2% сывороточный альбумин человека) на лунку и инкубировать в течение 1 ч в CO 2 инкубаторе при температуре 37 ° C.
- Тем временем подготовить 600 нм PMA решение в RPMI и добавить к клеткам 100 мкл на лунку. Инкубируйте от 15 минут до 4 часов в CO 2 инкубаторе при температуре 37 ° C.
- Fix клеток в 4% (на конец концентрации) параформальдегид растворяется в PBS.
PMA выступает в качестве положительного контроля и до сих пор самым мощным агентом, чтобы побудить NET образования. Кроме того, другие стимулы или совместное культивирование с патогенами могут быть использованы для NET индукции.
Соответствующих статусу NET образование может быть проверена, а время идет конечно, если дополнительные параллельные образцы подготовлены. Если, не проникающий ДНК красителя, как Sytox Зеленый (Invitrogen) добавляется к нефиксированным клеток, внеклеточной ДНК только будут обнаружены. С образованием новых НРТ-то нарушения в присутствии Sytox, для каждого момента времени один параллельный пример должен быть использован.
3. NET обнаружения immunolabeling
НРТ очень хрупкие, даже после фиксации и должны управляться с большой осторожностью, в противном случае большинство будет теряться во время подготовки.
- Осторожно снимите скользит стеклянной крышкой с прикрепленными клетки с 24-и культуру пластину, подняв ее вверх на границе с изогнутой иглой и схватить ее тонкой щипцами. Положите покрытие скольжения вниз головой на каплю PBS. Это можно сделать на листе парафильмом покрытия стоят пробирки. Вымойте так 3 раза в течение 5 мин.
- Инкубируйте крышка скользит в том же порядке в капле 0,5% Тритон Х-100 в течение 1 мин при комнатной температуре, чтобы permeabilize клеток. Промыть 3 раза в PBS в течение 1 мин.
- Подготовка влажной камере с парафильмом и мокрой ткани. Положите крышку скользит вверх тормашками на каплю блокирующим буфером (5% осла сыворотки) и инкубировать 30 минут при температуре 37 ° C.
- Развести первичных антител, например мс анти Хистон и РБ анти эластазы нейтрофилов, в блокирующем буфере.
- Передача крышка скользит по влажной камере непосредственно от блокирующего буфера на падение первичного антитела и инкубировать в течение 1 часа при температуре 37 ° C.
- Промыть 3 раза по 5 мин с PBS.
- Развести вторичными антителами, например, DK анти мс Су2 и ДК анти РБ Cy3, в блокирующем буфере.
- Передача крышка скользит в влажной камере на каплю вторичными антителами и инкубировать в течение 1 часа при температуре 37 ° C.
- Промыть 3 раза по 5 мин с PBS. В зависимости от вашего флуоресценции вариантов микроскопии, пятна ДНК в течение 5 мин или с Hoechst 33342 (1 мкг / мл), который понадобится УФ возбуждения или с Draq5 для дальнего красного возбуждения и мыть дважды расстояние. водой.
- Установить 20 мкл капли Mowiol на предметное стекло и смонтировать покрытие скользит с клетками с ног на голову. Клетки должны быть в пределах от скольжения крышкой и слайдов. Капля Mowiol образуют тонкий слой однородной толщины, когда покровным стеклом расположен на капли. Как правило, нет необходимости нажимать образца. Если вы хотите использовать не-погружения линз, образца готова к проверке.Для микроскопического анализа с погружением линзы, не говоря образца сохнуть в течение приблизительно 1 часа, пока Mowiol укрепил на границе образца.
4. Подготовка сети для сканирующей электронной микроскопии (SEM)
- Сообщение исправить клеток на стеклянные крышки скользит в 24-луночный планшет с 2,5% глутарового альдегида.
- Удалить стеклянная крышка скользит, содержащих клетки из 24-и культуру пластину и поставить вверх дном на каплю воды. Вымойте так 3 раза в течение 5 мин.
- Передача крышка скользит обратно в 24-луночных культуре клеток пластину, содержащую 0,5% OsO4 и инкубировать 30 мин.
- Удалить стеклянная крышка скользит, содержащих клетки из 24-и культуру пластину и поставить вверх дном на каплю воды. Вымойте так 3 раза в течение 5 мин.
- Передача крышка скользит обратно в 24-клеточной культуре также пластины, содержащей 1% дубильной кислоты и инкубировать 30 мин.
- Повторите шаги с 4,2 до 4,4
- Дегидрировать через такую схему (5 минут каждая):
- 30% этанола
- 50% этанола
- 70% этанола
- 80% этанола
- 90% этанола
- 100% этаноле
- 100% этаноле
- 100% этаноле
- Передача крышка скользит в критической точке сушилку и сухой образцы.
- Пальто поверхности образца с 5 нм платина / углерод слой с помощью тонкого слоя испарителя
5. Представитель Результаты:
Изоляции метод обычно дает нестимулированных жизнеспособных нейтрофилов с чистотой более 95%. При включенной в различные моменты времени после стимуляции иммунной протокол показана последовательность морфологических изменений при NETosis ячейки уплощение, утрата ядерной дольки, потеря гранул и ядро целостность, что приводит к увеличению перекрытия ядерных (т.е. гистонов) и гранулированной (т.е. эластазы нейтрофилов) окрашивания. Этот протокол может служить отправной точкой для анализа специфических взаимодействий патогенов с нейтрофилов. Это взаимодействие можно разрезать более подробно использованием подготовка протокола для сканирующей электронной микроскопии.
NET флуоресценции
Пример вынужденного нейтрофилов окрашивают в течение NET компонентов (синий = ДНК, красный = гистонов, зеленый = эластазы нейтрофилов). Изображения показывают, помимо NET локализации, ядерной локализации ДНК и гистонов и гранулированных шаблон для эластазы нейтрофилов.
SEM PMA стимуляции
Сканирующего электронного микроскопа показывает, не стимулируется и PMA-стимулированных нейтрофилов. После стимуляции нейтрофилов выравниваться и производить NET.
SEM Сети и шигеллы
Более высокое разрешение изображения SEM бактерий Shigella в ловушке NET.
Discussion
При условии, протокол позволит изоляции, не стимулировали нейтрофилов на значительном чистоты, индукция NET формирования и анализа морфологических изменений при NETosis. При работе с образцами с осторожностью, т.е. избежать суровых условий промывки, что приведет к потере большей части свободно прилагается сетей, количество NET образование в различных условиях стимуляции (длительность стимула), можно сравнить. В этой связи, при условии, протоколы могут служить отправной точкой для разработки методов для анализа более сложных сценариев: нейтрофилов / патогена взаимодействия, последовательность стимулов, взаимодействие с другими иммунными клетками.
References
- Brinkmann, V. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 Forthcoming.
- Urban, C. F., Reichard, U., Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps capture and kill Candida albicans yeast and hyphal forms. Cell Microbiol. 8, 668-676 (2006).
- M, E. Leishmania amazonensis promastigotes induce and are killed by neutrophil extracellular traps. PNAS. 106, 6748-6753 (2009).
- Buchanan, J. T., Simpson, A. J., Aziz, R. K., Liu, G. Y., Kristian, S. A., Kotb, M., Feramisco, J., Nizet, V. DNase expression allows the pathogen group A Streptococcus to escape killing in neutrophil extracellular traps. Curr Biol. 14, 396-400 (2006).
- Fuchs, T. A. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nat Rev Microbiol. 5, 577-582 (2007).
- Aga, E., Katschinski, D. M., van Zandbergen, G., Laufs, H., Hansen, B., Muller, K., Solbach, W., Laskay, T. Inhibition of the spontaneous apoptosis of neutrophil granulocytes by the intracellular parasite Leishmania major. J Immunol. , 169-898 (2002).
