Präparation Organizer und Animal Pole Explantate aus Xenopus laevis Embryos und Montage eines Cell Adhesion Assay

Zusammenfassung

Dieses Video zeigt die Technik für die Herstellung von Veranstalter und animalen Pol Explantaten aus Xenopus laevis Embryonen, einschließlich der Verwendung der Augenbraue Messer eingesetzt - ein spezialisiertes Werkzeug Dissektion einer Augenbraue gemacht. Das Protokoll zur Montage eines Adhäsionsassay ist auch gegeben, die Sonden für die Präsenz der wichtigsten Adhäsionsmoleküle auf der Oberfläche Veranstalter oder animalen Pol Zellen, die entscheidend für die richtige Entwicklung vorhanden sind.

Protokoll

Vorbereitung Adhesion Chambers (der Tag vor der Injektion / Dissektion)

Adhesion Assay Chambers

Wenn Sie eine herkömmliche zusammengesetzte Mikroskop (optisch lokalisiert über der Bühne) haben, ist es ncecessary um eine niedrige Bauhöhe Haftung Kammer wie folgt. Bei Verwendung des invertierten-Optik Mikroskop, dann "NUNC Lab-Tek Chambered Deckglas" kann nur verwendet werden, und überspringen Sie die Schritte # 1 bis 2.

1. Bringen Sie eine der "Press-to-Siegel Silizium-Isolator" auf einem 40 x 24mm Deckglas. Drücken Sie das Isolator das Deckglas auf sauberen Tisch-und schaue von der anderen Seite, um sicherzustellen, dass der Isolator vollständig ohne Luftblasen befestigt.
   
   
2. Optional: Legen Sie die Haftung Kammern in einer Glas-Petrischale mit Whatman-Filterpapier und Autoklaven in Trocken-Zyklus zu sterilisieren. Coole sie auf RT.

Die Beschichtung der Kammer

1. Legen Sie eine 200ml Tropfen funktionierende Lösung von Cadherin (10mg/ml) oder Fibronektin (20mg/ml) auf die Mitte eines autoklaviert Haftung Kammer mit sigmacoated gelben Spitzen. Inkubation bei RT für 4 Stunden.
   
   
2. Nehmen Sie die Cadherin oder Fibronektin-Lösung und Überführung in ein 1,5 ml Tube. Diese Lösung kann für die nächsten 2 Wochen wieder verwendet werden.
   
   
3. Dispense 500ml von 4% BSA in 1x MBS-H, um die Kammer zu blockieren. Inkubation bei RT für 1 Stunde.
   
   
4. Saugen Sie die BSA-Lösung. Waschen Sie die Kammer mit 500 ml 1x MBS-H zweimal. Nach dem zweiten waschen, saugen die meisten von MBS-H (nicht vollständig), und speichern Sie in einem verschlossenen Behälter bei 4 º C. Diese Haftung Kammer ist gut für die nächsten 2 bis 3 Tagen.

Dissection und Dissoziation von Animal Cap Explantate

1. Inkubieren Sie die injizierten Embryonen in 0,1 x MBS-H, aus dem autoklaviert 1x MBS-H verdünnt, als nicht autoklavierten Medium irgendwann trägt wenig Keime, die dissoziierten Tier Kappe Zellen stören kann.
   
   
2. Machen 1x Barths Agaroseplatten und CMF-MBS-Agarose-Platten mit 60mm Geschirr, mindestens so viele wie die Anzahl Ihrer Proben. Gießen autoklaviert 1x MBS-H auf 1x Barths Platten. Für CMF-MBS-Platten, pour 10ml CMF-MBS.
   
   
3. Wenn die Embryonen Bühne 8,5 werden, beginnen Sezieren der Tiere Kappen in einem 1x Barths Platte. 10 bis 15 Explantate pro Proben sind in der Regel genug für ein Experiment.
   
   
4. Übertragen Sie die Tier-cap Explantate zu einer CMF-MBS Platte. Inkubieren Sie die Explantate für 45 bis 60 Minuten, bis die Explantate vollständig dissoziiert sind. Sanfte Agitationen in alle 15 Minuten wird dazu beitragen, die Dissoziation.

Cell Adhesion Assay

1. Aussaat der Zellen: Dispense 500ml 1x MBS-H, um die Haftung Kammer in die Schritte in den vorstehenden Abschnitten, Adhesion Assay Chambers und Beschichtung der Kammer vorbereitet. Übertragen Sie die dissoziierten Tier Kappe Zellen aus dem CMF-MBS Platte, um die Haftung Kammer mit P200 mit einem sigmacoated und abgehackten gelben Spitzen.
   
   
2. Optional: Wenn möglich, sorgfältig saugen das Medium bis zu ca. 2 / 3 auf halbem Weg, ohne dass Zellen in die Luft. Fügen Sie etwa die gleiche Menge an frischem MBS-H, um sicherzustellen, dass das Medium ausreichend Ca ^{2 +} und Mg ^{2 +.}
   
   
3. Inkubation bei RT für 45 bis 90 Minuten. Überprüfen Sie die Zellen gelegentlich zu sehen, ob sie an der Bodenfläche Befestigung sind.
   
   
4. Jetzt können Sie das Bild der Zellen unter dem Mikroskop.
   
   
5. Legen Sie die Haftung Kammer auf einem Raster Objektträger. Richten Sie eine der Ecken der Haftung Kammer in eine Ecke des Rasters gleiten. Graf und notieren Sie die Nummer des anhaftenden Zellen in verschiedene Netze.
   
   
6. Gießen Sie 1 Liter MBS-H in einem großen Plastikeimer (zB Tupperware, etc.). Sanft legte die Haftung schieben Kammer auf den Boden des Eimers. Drehen Sie es auf dem Schüttler für 5 Minuten bei niedriger Geschwindigkeit (50 - 60rpm).
   
   
7. Legen Sie die Haftung Kammer wieder am Netz schieben, Ausrichten der gleichen Ecke der Kammer auf die gleiche Ecke des Rasters schieben, wie in Schritt 5 dieses Abschnitts, Cell Adhesion Assay durchgeführt wurde. Zählt die Anzahl der Zellen, die auf dem gleichen Raster, das Sie vor dem Waschen gezählt verbunden bleiben. Berechnen Sie den Prozentsatz an Zellen, die nach dem Waschen verbunden bleiben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1x MBS-H	Pufferlösung			Modifizierter Barth’s Medium: Rezeptur für 1 L: 5,14 g NaCl, 75 mg KCl, 0,2 g NaHCO₃3 0,2 g MgSO₄4•7H2O 60 mg CaCl2•2H2O 80 mg Ca(NO3)2•4H2O2. 38 g HEPES, freie Säure. Den pH mit NaOH auf 7,4 einstellen. Autoklavieren.
CMF-MBS	Pufferlösung			Dies ist Ca2+/Mg2+-freie Version von MBS-H. Rezeptur für 500 mL: 2,57 g NaCl, 37,5 mg KCl, 0,1 g NaHCO₃3/Unterabschnitt> 1,19 g HEPES, freie Säure. Den pH-Wert mit NaOH auf 7,4 einstellen. Autoklavieren.
1 % Agarose/1x Barth’s-Platten				so viele wie die Anzahl der Proben
1 % Agarose/CMF-MBS-Platten				so viele wie die Anzahl der Proben
E-Cadherin/Fc-Chimäre	Reagenz	Sigma-Aldrich	E-2278	Lösen Sie 0,1 mg festes E-Cadherin in 100 µl 1x MBS-H, das 40 % Glycerin enthält, um einen 100x Stammpuffer (1,0 mg/ml) herzustellen. Lagern Sie ihn in –20 °C. Stellen Sie kurz vor der Verwendung eine 1:100-Verdünnung mit 1x MBS-H her, um eine Arbeitslösung mit 10 µg/ml zu erhalten. Pro Probe benötigen Sie 200 µl dieser Arbeitslösung.
Fibronectin, 0,1%-Lösung	Reagenz	Sigma-Aldrich	F-1141	Diese Fertiglösung kann als 50x-Stammlösung verwendet werden. Verdünnen Sie 1:50 mit 1x MBS-H, um 20 μg/mL Arbeitslösung unmittelbar vor der Verwendung. Sie benötigen 200 μL pro Probe dieser Arbeitslösung. Ich empfehle ausdrücklich nicht die Verwendung von festem Fibronectin, da es schwierig ist, es in einer Konzentration von 0,1 % zur Herstellung der Stammlösung aufzulösen. Obwohl diese vorgefertigte 0,1-%-Lösung teurer ist, führt sie zu konsistenteren Ergebnissen.
4 % BSA / MBS-H	Pufferlösung			BSA: Fraktion V, molekularbiologische Qualität
gelbe Spitzen mit Sigmacote-Beschichtung	Werkzeug
Deckgläser Nr. 1				40 mm x 24 mm oder 60 mm x 24 mm
Druckdichter Silikonisolator	Werkzeug	Glace Bio-Labs	JTR20-2.5	2,5 mm Tiefe x 20 mm Durchmesser
NUNC Lab-Tek Kammerobjektträger	Werkzeug	Fisher Scientific	12-565-471	2 Vertiefungen/Objektträger
Rasterobjektträger	Werkzeug			oder Finder-Teilung für die Zellzählung