Dieses Video zeigt die Technik für die Herstellung von Veranstalter und animalen Pol Explantaten aus Xenopus laevis Embryonen, einschließlich der Verwendung der Augenbraue Messer eingesetzt - ein spezialisiertes Werkzeug Dissektion einer Augenbraue gemacht. Das Protokoll zur Montage eines Adhäsionsassay ist auch gegeben, die Sonden für die Präsenz der wichtigsten Adhäsionsmoleküle auf der Oberfläche Veranstalter oder animalen Pol Zellen, die entscheidend für die richtige Entwicklung vorhanden sind.
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Methodenartikel
Präparation Organizer und Animal Pole Explantate aus Xenopus laevis Embryos und Montage eines Cell Adhesion Assay
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Protokoll
Vorbereitung Adhesion Chambers (der Tag vor der Injektion / Dissektion)
Adhesion Assay Chambers
Wenn Sie eine herkömmliche zusammengesetzte Mikroskop (optisch lokalisiert über der Bühne) haben, ist es ncecessary um eine niedrige Bauhöhe Haftung Kammer wie folgt. Bei Verwendung des invertierten-Optik Mikroskop, dann "NUNC Lab-Tek Chambered Deckglas" kann nur verwendet werden, und überspringen Sie die Schritte # 1 bis 2.
- Bringen Sie eine der "Press-to-Siegel Silizium-Isolator" auf einem 40 x 24mm Deckglas. Drücken Sie das Isolator das Deckglas auf sauberen Tisch-und schaue von der anderen Seite, um siche....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare | |
|---|---|---|---|---|
| 1x MBS-H | Pufferlösung | Modifizierter Barth’s Medium: Rezeptur für 1 L: 5,14 g NaCl, 75 mg KCl, 0,2 g NaHCO₃3 0,2 g MgSO₄4•7H2O 60 mg CaCl2•2H2O 80 mg Ca(NO3)2•4H2O2. 38 g HEPES, freie Säure. Den pH mit NaOH auf 7,4 einstellen. Autoklavieren. | ||
| CMF-MBS | Pufferlösung | Dies ist Ca2+/Mg2+-freie Version von MBS-H. Rezeptur für 500 mL: 2,57 g NaCl, 37,5 mg KCl, 0,1 g NaHCO₃3/Unterabschnitt> 1,19 g HEPES, freie Säure. Den pH-Wert mit NaOH auf 7,4 einstellen. Autoklavieren. | ||
| 1 % Agarose/1x Barth’s-Platten | so viele wie die Anzahl der Proben | |||
| 1 % Agarose/CMF-MBS-Platten | so viele wie die Anzahl der Proben | |||
| E-Cadherin/Fc-Chimäre | Reagenz | Sigma-Aldrich | E-2278 | Lösen Sie 0,1 mg festes E-Cadherin in 100 µl 1x MBS-H, das 40 % Glycerin enthält, um einen 100x Stammpuffer (1,0 mg/ml) herzustellen. Lagern Sie ihn in –20 °C. Stellen Sie kurz vor der Verwendung eine 1:100-Verdünnung mit 1x MBS-H her, um eine Arbeitslösung mit 10 µg/ml zu erhalten. Pro Probe benötigen Sie 200 µl dieser Arbeitslösung. |
| Fibronectin, 0,1%-Lösung | Reagenz | Sigma-Aldrich | F-1141 | Diese Fertiglösung kann als 50x-Stammlösung verwendet werden. Verdünnen Sie 1:50 mit 1x MBS-H, um 20 μg/mL Arbeitslösung unmittelbar vor der Verwendung. Sie benötigen 200 μL pro Probe dieser Arbeitslösung. Ich empfehle ausdrücklich nicht die Verwendung von festem Fibronectin, da es schwierig ist, es in einer Konzentration von 0,1 % zur Herstellung der Stammlösung aufzulösen. Obwohl diese vorgefertigte 0,1-%-Lösung teurer ist, führt sie zu konsistenteren Ergebnissen. |
| 4 % BSA / MBS-H | Pufferlösung | BSA: Fraktion V, molekularbiologische Qualität | ||
| gelbe Spitzen mit Sigmacote-Beschichtung | Werkzeug | |||
| Deckgläser Nr. 1 | 40 mm x 24 mm oder 60 mm x 24 mm | |||
| Druckdichter Silikonisolator | Werkzeug | Glace Bio-Labs | JTR20-2.5 | 2,5 mm Tiefe x 20 mm Durchmesser |
| NUNC Lab-Tek Kammerobjektträger | Werkzeug | Fisher Scientific | 12-565-471 | 2 Vertiefungen/Objektträger |
| Rasterobjektträger | Werkzeug | oder Finder-Teilung für die Zellzählung |
Nachdrucke und Genehmigungen
