Wir zeigen, ein Protokoll zu chimären Zebrafischembryonen für Live-Imaging-zelluläres Verhalten während der Embryogenese zu generieren.
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Methodenartikel
Die Transplantation von GFP-exprimierenden Blastomeren für Live Imaging von Retinal und Entwicklung des Gehirns in Chimäre Zebrafischembryonen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Cells ändern ausgiebig in ihren Standorten und Immobilien während der Embryogenese. Diese Veränderungen werden durch die Wechselwirkungen zwischen den Zellen und ihrer Umgebung reguliert wird. Chimäre Embryonen, die aus Zellen verschiedener genetischer Hintergrund bestehen, sind großartige Werkzeuge, um die Zell-Zell-Interaktionen von Genen von Interesse vermittelt zu studieren. Die embryonale Transparenz der Zebrafisch am frühen Entwicklungsstadien ermöglicht die direkte Visualisierung der Morphogenese von Geweben und Organen auf der zellulären Ebene. Hier zeigen wir, ein Protokoll zu chimären Netzhaut und Gehirn in Zebrafisch-Embryonen zu erzeugen und zu leben Bildgebung des Spenders Zellen durchzuführen. Das Protokoll umfasst die Vorbereitung auf die Transplantation Nadeln, die Transplantation von GFP-exprimierenden Spender Blastomeren zu GFP-negative Hosts und die Prüfung der Spender das Verhalten der Zelle unter Live-konfokale Mikroskopie. Mit leichten Modifikationen kann dieses Protokoll auch verwendet, um die embryonale Entwicklung von anderen Geweben und Organen im Zebrafisch zu untersuchen. Die Vorteile der Verwendung von GFP zu markieren Spenderzellen werden ebenfalls diskutiert.
Protokoll
Tag 1. Vorbereitung
1. Set up Fisch Kreuze
Set up paarweise Kreuze Zebrafisch in den Abend. Um zu verhindern, zufällige Paarung vor der gewünschten Zeit nutzen, um so zu den weiblichen und männlichen Fischen in der Paarung Kassetten zu trennen. GFP-exprimierenden transgenen Fische sind als eine Quelle der Spender Blastomeren verwendet. Die pt104 transgene Linie (Zou et al., 2008), hier verwendet wird, drückt GFP ubiquitär unter der Kontrolle des EF1-Promotor. GFP-Expression ermöglicht die Visualisierung von Spenderzellen mit Live-Bildgebung. Andere transgene Fische Linien, die geeignete fluoreszierende Pro....
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Diskussion
In diesem Video zeigen wir eine Methode zur Blastomere Transplantation der Retina und die Entwicklung des Gehirns beim Zebrafisch zu analysieren. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um die Entwicklung von anderen Geweben und Organen durch einfaches Loslassen der Spender Blastomeren zu entsprechenden Stellen in den Host-Embryonen zu analysieren. Die Markierung mit GFP-Moleküle führt zu einem saubereren Hintergrund als Markierung mit Fluoreszenzfarbstoff-konjugierten Dextran (Ho und Kane 1990). Dies liegt daran, .......
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Danksagungen
NIH Grant R01EY016099 und Forschung zur Erblindung Career Development Award Prevent: Diese Studie wurde von der National Institutes of Health (NIH) Core Grant (5P30EY008098) und die folgenden Mittel zur XW unterstützt. Wir bedanken uns bei Kira Lathrop um Hilfe bei der konfokalen Bildgebung.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
E3 Ei Wasser:
- 5 mM NaCl
- 0,17 mM KCl
- 0,33 mm CaCl 2
- 0,33 mm MgSO 4
- 0,1% Methylenblau
Referenzen
- Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).
- Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). TH....
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Nachdrucke und Genehmigungen
