Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Zhao et al., In Vivo Surface Electrocardiography for Adult Zebrafish, J. Vis. Exp.(2019).
Alle Experimente in dieser Studie wurden in Übereinstimmung mit dem US National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt. Alle Tierprotokolle in dieser Studie wurden vom UCLA Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt.
1. Einleitung der Anästhesie
- Bereiten Sie eine Immersionsanästhesie zur Schmerzkontrolle und Immobilisierung von Fischen vor, um Bewegungsartefakte während der EKG-Datenerfassung zu vermeiden. Die meisten Laboratorien verwenden Immersions-Tricain (Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonat, MS-222).
- Um die 0,4%ige Tricain-Stammlösung herzustellen, kombinieren Sie die folgenden Elemente in einer dunklen Glasflasche mit Schraubverschluss: 400 mg Tricainpulver, 98 ml doppelt destilliertes Wasser und 2 ml 1 M Tris (pH 9). Stellen Sie bei Bedarf 1 N NaOH oder 1 N HCl auf pH 7,0 ein.
- Um die endgültige Immersionslösung von Tricain herzustellen, bestimmen Sie die Mindestkonzentration, die für das Alter, die Größe, den Stoffwechselzustand, den Stamm, das Krankheitsmodell, die wissenschaftlichen Ziele und die Verfahrensdauer des Zebrafisches geeignet ist.
- Führen Sie eine Tricain-Konzentrations-Wirkungs-Studie durch und titrieren Sie bei Bedarf von der empfohlenen Konzentration von 168 mg/l (oder 0,0168 %)9nach oben oder unten, um innerhalb von 3 Minuten Anästhesiestufe 4 mit möglichst geringen kardiorespiratorischen Toxizitäten zu erreichen. Zum Beispiel induziert in dieser Studie das Eintauchen von Wildtyp-AB-Zebrafischen im Alter von 12-18 Monaten in eine 0,02-0,04%ige Tricainlösung innerhalb von 3 min.
HINWEIS: Auf Stufe 4 der Anästhesie gehen das Gleichgewicht und der Muskeltonus vollständig verloren und die Bewegungsgeschwindigkeit der Oper wird reduziert.
- Wenden Sie sich erforderlichenfalls an den Tierarzt des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), um zusätzliche Hinweise zur Angemessenheit der Auswahl des Anästhetikums und des Verabreichungswegs zu erhalten.
- Tauchen Sie einen erwachsenen Zebrafisch in eine Schale, die Tricainlösung der niedrigsten vorgegebenen und von der IACUC zugelassenen Konzentration (z. B. 0,02-0,04 % in dieser Studie) enthält, um innerhalb von 3 Minuten eine Anästhesie der Stufe 4 einzuleiten (Abbildung 1).
- Halten Sie die EKG-Aufzeichnung für das Überlebens-EKG-Protokoll so kurz wie möglich (unter 10 Minuten). Bei kurzen EKG-Aufzeichnungen, die weniger als 15 Minuten dauern, ist eine Narkoseerhaltung nicht erforderlich.
- Verwenden Sie bei langen, stundenlangen EKG-Aufzeichnungen ein langwirksames intramuskuläres Lähmungs- und ein orales Perfusionssystem, um ausreichend Feuchtigkeit und Sauerstoffversorgung zu gewährleisten.
>2. Platzierung der EKG-Elektrode
- Sobald der Zebrafisch die Anästhesiestufe 4 für 3 s aufrechterhält, verwenden Sie eine stumpfe Pinzette, um den Fisch sofort auf den feuchten Schwammschlitz zu übertragen, wobei die Bauchfläche nach oben zeigt, um die EKG-Elektroden zu platzieren (Abbildung 2).
- Führen Sie die drei EKG-Ableitungselektroden vorsichtig bis zu einer Tiefe von ca. 1 mm in die Fischmuskulatur ein, um eine bipolare Ableitung in der Frontalebene zu etablieren, die parallel zur linken kaudal-rechten kranialen Ausrichtung der kardialen Hauptachse verläuft.
- Positionieren Sie die positive (rote) Elektrode in der ventralen Mittellinie auf Höhe des Bulbus arteriosus, d.h. 1-2 mm über einer imaginären Linie, die die beiden unteren Ränder des Operculums verbindet (Abbildung 2A).
- Positionieren Sie die negative (schwarze) Elektrode kaudal und 0,5-1,0 mm links seitlich zur positiven Elektrode, in einem Abstand, der größer ist als die maximale apikobasale Länge des adulten Zebrafischventrikels (Abbildung 2A).
- Positionieren Sie die Referenzelektrode (grün) kaudal in der Nähe der Analregion.
HINWEIS: Da die kardiale Hauptachse von Fisch zu Fisch etwas unterschiedlich ist, sollten Sie zur Maximierung der R- und T-Wellenamplituden die Führungspositionen anpassen, indem Sie nur kleine, systematische Änderungen durch Versuch und Irrtum vornehmen. Wechseln Sie z. B. jeweils eine Elektrode (positiv oder negativ) anstelle beider Elektroden und nehmen Sie allmähliche Änderungen in eine bestimmte Richtung vor, bevor Sie in eine andere Richtung wechseln, anstatt unregelmäßige Änderungen in zufällige Richtungen vorzunehmen.
>3. EKG-Aufzeichnung
- Öffnen Sie das EKG-Datenerfassungsprogramm. Wählen Sie eine gewünschte Einstellung aus den Dropdown-Menüs für Bereich, Tiefpass und Hochpass aus. Zum Beispiel ergibt die folgende Einstellung im In-vivo-EKG-Aufzeichnungssystem, das in diesem Experiment verwendet wurde, ein konsistentes, zufriedenstellendes Signal-Rausch-Verhältnis für einen normalen erwachsenen Zebrafisch: Bereich "2 mV", Tiefpass "120 Hz" und Hochpass "0,03 s".
- Drücken Sie Start, um eine kontinuierliche lückenlose EKG-Aufzeichnung mit einer Abtastrate von 1 kHz zu starten.
- Um die Ableitungspositionierung für ein maximales Signal-Rausch-Verhältnis zu optimieren, drücken Sie Stopp, um die EKG-Aufzeichnung zu stoppen und die EKG-Spur kurz nach dem allerersten Aufzeichnungsversuch für jedes Herz zu überprüfen. Um zu diagnostizieren, ob ein EKG eines adulten Zebrafisches normal ist, bestätigen Sie, dass alle der folgenden vier Validierungskriterien erfüllt sind (Abbildung 3):
- Kriterium 1: Stellen Sie sicher, dass alle EKG-Wellenformen (P, QRS und T) eindeutig und gut sichtbar sind.
- Kriterium 2: Stellen Sie sicher, dass die P-Welle positiv ist.
- Kriterium 3: Stellen Sie sicher, dass der Netto-QRS-Komplex positiv ist (d. h. die R-Wellenamplitude ist größer als die Summe der Q- und S-Wellenamplituden).
- Kriterium 4: Stellen Sie sicher, dass die T-Welle positiv ist.
- Wenn ein normales EKG erwartet wird, positionieren Sie die Elektroden bei Bedarf neu (probieren Sie zuerst die negative Elektrode aus), bis alle vier Validierungskriterien erfüllt sind.
- Wenn eine normale T-Welle erwartet wird, die T-Welle jedoch zu klein ist, positionieren Sie die Elektroden neu, um die T-Wellenamplitude zu maximieren.
- Setzen Sie die EKG-Aufzeichnung fort, nachdem Sie die Elektrodenpositionierung optimiert haben. Speichern Sie die EKG-Sweeps für die spätere Analyse.
>4. Genesung von der Narkose
- Entfernen Sie am Ende der EKG-Aufzeichnung vorsichtig die Elektroden, ohne den Fisch zu verletzen. Den Fisch in frisches, sauerstoffreiches Fischwasser umfüllen, das frei von Tricain ist.
- Um die Genesung von der Narkose zu erleichtern, spritzen Sie mit einer Pasteur-Pipette kräftig Wasser über die Kiemen, bis der Fisch wieder seine normale Kiemenbewegung oder sein Schwimmen aufnimmt.
- Überwachen Sie den Fisch auf eine vollständige Genesung von der Narkose (in der Regel 1-2 Minuten), was sich in der Fähigkeit des Fisches zeigt, mindestens 5 s lang aufrecht zu schwimmen.
