In diesem Video-Artikel präsentieren wir eine Methode zur Isolierung von einzelnen oder mehreren Drosophila Da Neuronen aus dritten Larvenstadium mit der Infrarot-Aufnahme (IR)-Klasse von Laser Capture Mikrodissektion (LCM). RNA aus den isolierten Neuronen erhalten können leicht für nachgelagerte Anwendungen wie qRT-PCR oder Microarray-Analysen verwendet werden.
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Methodenartikel
Laser Capture Mikrodissektion von Drosophila Peripheren Neuronen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die dendritischen Verzweigung (da) Neuronen des Drosophila peripheren Nervensystem (PNS) liefern ein hervorragendes Modell, in dem die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen klassenspezifischen Dendriten Morphogenese 1,2 untersuchen. Zur Erleichterung der molekularen Analyse von klassenspezifischen da Neuron Entwicklung ist es wichtig, diese Zellen in eine reine Population zu erhalten. Obwohl eine Reihe von verschiedenen Zell-und Gewebe-spezifische RNA-Isolierung Techniken existieren für Drosophila-Zellen, einschließlich Magnetic-Bead-basierten Zellreinigung 3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) 5-8, und RNA bindenden Proteins Strategien 9, keine Diese Methoden können leicht zur Isolierung von einzelnen oder mehreren Klassen-spezifischen Drosophila da Neuronen mit einem hohen Grad an räumlicher Präzision eingesetzt werden. Laser Capture Mikrodissektion (LCM) wurde als ein äußerst leistungsfähiges Werkzeug, das benutzt, um bestimmte Zelltypen aus Gewebeschnitten isoliert mit einem hohen Grad an räumlicher Auflösung und Genauigkeit kann entstanden. RNA aus isolierten Zellen erhalten kann dann für Analysen einschließlich qRT-PCR und Microarray-Expression Profiling innerhalb einer bestimmten Zelltyp 10-16 verwendet werden. Bis heute hat LCM nicht umfassend in die Analyse von Drosophila Gewebe und Zellen 17,18, einschließlich da Neuronen an der dritten Larvenstadium Larvenstadium der Entwicklung eingesetzt.
Hier präsentieren wir unsere optimiertes Protokoll für die Isolierung von Drosophila da Neuronen mit der Infrarot-(IR)-Klasse von LCM. Diese Methode ermöglicht die Erfassung von Einzel-, Klassen-spezifischen oder mehrere da Neuronen mit hoher Spezifität und räumlicher Auflösung. Alter abgestimmten dritten Larvenstadium Ausdruck eines UAS-mCD8:: GFP 19 Transgen unter der Kontrolle von entweder der Klasse IV da Neuron spezifischen ppk-GAL4 20 Treiber oder in den gesamteuropäischen da Neuron spezifischen 21-7-GAL4 21 Treiber wurden für diese verwendet Experimente. RNA aus den isolierten da Neuronen erhalten ist von sehr hoher Qualität und kann direkt für nachgelagerte Anwendungen, einschließlich qRT-PCR oder Microarray-Analysen verwendet werden. Darüber hinaus kann diese LCM-Protokoll leicht angepasst werden, zu erfassen anderen Drosophila Zelltypen eine verschiedene Stadien der Entwicklung abhängig vom Zelltyp spezifisch, GAL4-driven Expressionsmuster von GFP.
Protokoll
Allgemeine Bemerkungen zum LCM von Drosophila peripheren Neuronen
Allow from 6 Stunden, bis zu einer Woche oder länger für LCM je nach Gewebetyp und die Anzahl der Zellen erforderlich.
Alle Verfahren sind in streng RNase-freien Bedingungen gemäß Standardverfahren durchgeführt. Larven, die entweder 21-7-GAL4, UAS-mCD8:: GFP oder ppk-GAL4, UAS-mCD8:: GFP transgenen Reporter Linien wurden für diese Experimente verwendet.
1. Vorbereitung der Larven
- Sammeln 30-40 gleichaltrigen dritten Larvenstadium und waschen Sie sie in ddH 2 O, gefolgt v....
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Diskussion
Das Protokoll hier vorgestellte beschreibt unsere optimierte Methode zur Isolierung von Drosophila peripheren Neuronen über LCM. Während dieser LCM-Protokoll für die spezifische Isolierung von Einzel-, Klassen-spezifischen oder mehrere Drosophila da Neuronen ab dem dritten Larvenstadium Larvenstadium der Entwicklung konzipiert wurde, konnte geringfügige Änderungen des Protokolls ohne weiteres für den Fang von anderen Drosophila Zelltypen aus allen Entwicklungs angepasst werden Phasen mit unter.......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Wir danken Drs. Yuh-Nung Jan und Wes Grueber für die Bereitstellung von fly Aktien in dieser Studie verwendet wird, und Virginia Espina, Dr. Emanuel Petricoin und Dr. Lance Liotta für die Unterstützung bei LCM. Die Autoren danken Thomas F. und Kate Miller Jeffress Memorial Trust für die Unterstützung dieser Forschung (DNC) und der George Mason University Provost s Office (EPRI).
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
Ausstattung:
- Kryostat
- 50 ml konischen Rohr für Dia-Fixierung, Spülen, Trypsin-Behandlung und Ethanol / Xylol Dehydration
- -80 ° C Gefrierschrank
- Inkubator
- PixCell IIe LCM Instrument mit Fluor 300 Epifluoreszenz-Optik für EGFP (Molecular Devices-Molecular Devices) optimiert
Referenzen
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
